[發明專利]一株高產黃曲霉毒素M1的寄生曲霉及其應用

在審

• 申請號: 202210849586.3
• 申請日: 2022-07-19
• 公開（公告）號: CN115926997A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 宮斌;曹建華;吳子文
• 申請（專利權）人: 青島貞開生物醫藥技術有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P17/18;C12R1/66
• 代理公司: 北京識然知識產權代理事務所(普通合伙) 11975
• 代理人: 曾慶國

本發明提供一株高產黃曲霉毒素M1的寄生曲霉，該菌株用于發酵制備AFT?M1以及supgt;13/supgt;Csubgt;17/subgt;?AFT?M1內標物，發酵液中AFT?M1的含量能夠達到98.05mg/L，supgt;13/supgt;Csubgt;17/subgt;?AFT?M1的含量能夠達到11.67mg/L，能夠實現AFT?M1的規模化制備。所提供的AFT?M1的寄生曲霉(Aspergillus?parasiticus)zk0523株的保藏編號為CCTCC?NO：M2022990。本發明所篩選獲得的寄生曲霉zk0523相比于已有的發酵用菌種，發酵產物中AFT?M1的含量明顯升高，可規模化制備AFT?M1以及supgt;13/supgt;C穩定同位素標記的supgt;13/supgt;Csubgt;17/subgt;?AFT?M1。

技術領域

本發明屬于微生物發酵制備技術領域，具體涉及一株高產黃曲霉毒素M1的寄生曲霉及其應用

背景技術

黃曲霉毒素M1(Aflatoxin?M1，AFT?M1)被國際癌癥研究機構列為Ⅰ類致癌物，是動物攝入含有黃曲霉毒素B1的飼料后,在體內經肝微粒體細胞色素P450羥基化所形成的代謝產物,以乳及乳制品的污染最為常見，在乳品加工過程中不會被破壞降解，殘留超標將對消費者特別是嬰幼兒的健康帶來嚴重危害。我國對乳及乳制品中AFT?M1的限量標準為0.5ug/kg(食品安全國家標準《食品中真菌毒素限量GB2761—2017》)。

食品安全國家標準《食品中黃曲霉毒素M族的測定?GB5009.24—2016》規定了3種AFT?M1的檢測方法：同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法、高效液相色譜法及酶聯免疫吸附篩查法。檢測方法中使用的AFT?M1標準品及¹³C穩定同位素標記的¹³C₁₇-AFT?M1內標物難以制備，長期依賴進口，價格昂貴，導致AFT?M1的檢測成本居高不下。目前公開報道的獲得AFTM1的方法主要有寄生曲霉或黃曲霉微生物發酵法以及化學合成法。而¹³C₁₇-AFT?M1內標物的制備方法未見文獻報道。

胡文娟等(胡文娟等，衛生研究，1980(03)，20-23)篩選出產AFT?M1的477號和116號菌株，實驗測定發酵產物中AFT?M1的含量分別為4.8mg/kg、11.2mg/kg。Pai(Pai?etal,Applied?Microbiology,1975,29(6),?850-851)和Stubblefield(Stubblefield?etal,J.Am.Oil?Chem.Soc.1970,47,?389-390)分別用黃曲霉Aspergillus?flavus?NRRL?3251在液體合成培養基、大米培養基中發酵，AFT?M1的含量分別為10.3mg/L、20mg/kg。Purchase等人(Purchase?et?al,Mycopathologia?Et?Mycologia?Applicata,1968,35,?239-244)對27種黃曲霉或寄生曲霉菌株在不同培養基中產AFT?M1情況進行了研究，結果表明AFT?M1的含量最高為7.5mg/kg。寄生曲霉NRRL?2999的AFT?M1產量也僅有4ug/kg(Jiirgen,ZLebensm?Unters?Forsch，?1981,172,26-29)。以上使用的菌株以及發酵方法均未能實現AFT?M1的高產。

Christou等(Christou?etal，Phytochemtry,1985,24(5),933-935)試圖以黃曲霉毒素B1為原料，通過包括二氧化錫氧化乙酰基保護的黃曲霉毒素B1在內的4步化學轉換法制備AFT?M1，但反應轉化率低、副反應多、分離困難，收率僅有0.03％，且由于原料本身價格昂貴，因此該方法無實際應用價值。Buch等(Buch?et?al,J.Am.Chem.Soc.1981,103,?3497-3501)報道了一種AFT?M1的全合成方法，該合成路線制備過程復雜，總步驟長達26步，涉及使用多種危險試劑、多步復雜及危險反應，主路線總收率僅1～5％，難以短時間內實現大量、低成本的制備，且最遺憾的是所制備的產物是AFT?M1的消旋體，不能用于酶聯免疫檢測法。