[發明專利]一種小黑楊單倍體細胞系的獲得方法

在審

• 申請號: 202210847072.4
• 申請日: 2022-07-07
• 公開（公告）號: CN115058381A
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發明（設計）人: 曲冠證;劉彩霞;由香玲;陳肅;樊二勤
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;A01H4/00;C12R1/91
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開一種小黑楊單倍體細胞系的獲得方法，以單核靠邊期的小黑楊花藥為外植體，將消毒處理好的花藥放入愈傷組織誘導培養基中誘導出愈傷組織。通過流式細胞儀分析篩選出單倍體愈傷組織，將單倍體愈傷組織轉移到增殖培養基中進行增殖培養，生長成適合懸浮培養的狀態，將適宜的愈傷組織轉移到液體培養基中，成為穩定的懸浮細胞系。本發明以單倍體具有極高的變異率為出發點，結合植物懸浮細胞培養技術，首次在林木中獲得生長穩定的懸浮細胞系同時建立植株再生體系，為進一步通過單倍體誘導獲得楊樹優良品細胞系和新品種提供了技術支持。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，主要涉及通過組織培養獲得一種適合懸浮培養且具有分化再生能力的小黑楊(Populus simonii×P.nigra)單倍體細胞系的方法。

背景技術

植物細胞懸浮培養是指將質地松散、生長旺盛的植物愈傷組織轉移至液體培養基中，通過不斷振蕩培養，獲得具有一定細胞密度懸浮液的培養方法。由于懸浮細胞培養的營養和空氣等條件很容易控制，能促使細胞快速增殖，可大大縮短研究周期，從而為植物生理學、細胞生物學、分子生物學等領域研究提供極大的幫助。但是植物細胞具有結團生長的特性，僅靠激素處理等方式很難獲得良好的懸浮培養效果，且只有某些特定的基因型才可能賦予細胞系具有良好的懸浮培養特性，而且由于基因型的改變，通常也會產生一定的不利影響。目前最著名的植物細胞系是Kato等在1972年發現的煙草BY-2細胞系(Kato等,Society of Fermentation Technology,Osaka,1972,pp,689-695)，以及擬南芥懸浮細胞系T87(Ogawa等,Plant and Cell Physiology,2008,49(2):242–250)。這兩種細胞系具有優異的液體懸浮生長及遺傳學特征，尤其BY-2細胞系，其懸浮培養具有分散性強，且接種一周細胞增殖量可達初始量的80-100倍(Nagata等,International review ofcytology.Elsevier.1992:1-30)的優良特征，在當時作為世界上生長速度最快的植物細胞系，被譽為植物領域的HeLa細胞系，而受到研究者的廣泛使用。

盡管如此，這兩種懸浮細胞系都存在著一些明顯缺陷，例如BY-2細胞系基因組較大(約4.5Gbp)，且為雜合度較高的四倍體，導致至今沒有獲得理想的基因組組裝數據，且BY-2細胞系不能產生葉綠體，也無法再生完整植株；擬南芥T87細胞系可以產生葉綠體，但無法再分化形成植株，而且作為草本細胞系，都無法代替木本植物細胞系，進行木材形成調控等領域的研究，從而限制了其在研究木本植物領域的廣泛使用。

相對草本植物而言，木本植物典型的特征是可以保持持續的次生生長。在木本植物中，由于楊樹適應性強，分布廣泛，同時具有生長迅速、易繁殖等優點，成為當今世界上主要的造林樹種。國內外不少團隊利用楊樹細胞懸浮培養技術進行了研究：利用白楊(Populus alba L.)懸浮細胞系培養建立了植株再生體系，獲得了完整的植株(Park和Son,Plant Cell Rep.1988,7(7):567-570；Ohmiya等,Plant Cell Physiol.1995,36(4):607-614)；利用雜交楊(Populus alba×Populus tremula var.glandulosa)懸浮細胞系進行鹽脅迫下基因表達情況的分析(Bae等,Plant Physiol Biochem.2012,58:151-158)及纖維素生物合成機制研究(Ohlsson等,Protoplasma.2006,228(4):221-229)；利用青楊懸浮細胞系進行原生質體分離及培養研究(黃振,博士學位論文，北京：北京林業大學,2015)。但以上楊樹細胞系因為存在生長速度慢、容易結塊而懸浮效果不佳等缺點，導致不能被廣泛、持續利用。

本發明基于植物單倍體群體具有非常高的遺傳變異率這一理論，從獲得的大量小黑楊單倍體細胞系群體中，篩選出生長快速、分散性優良適合懸浮培養的細胞系且具有植株再生能力。本發明將為相關領域的研究提供強有力的實驗工具。

發明內容

本發提供一種小黑楊單倍體細胞系的獲得方法，具體內容如下：