[發明專利]檢測獼猴桃褪綠環斑病毒的引物對、引物組、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202210846901.7
• 申請日: 2022-07-19
• 公開（公告）號: CN116083642A
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 劉占德;張阿玲;史遐;劉艷飛;余楓
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 張秋菊

本發明屬于病毒檢測技術領域，具體涉及檢測獼猴桃褪綠環斑病毒的引物對、引物組、試劑盒及方法。本發明提供的引物對RPA?AcCRaV?F/RPA?AcCRaV?R，能夠擴增獼猴桃褪綠環斑病毒的基因組RNA，特異性好，實現獼猴桃褪綠環斑病毒的檢測。將所述引物對與探針結合使用，得到檢測獼猴桃褪綠環斑病毒的引物組，能直接對獼猴桃褪綠環斑病毒進行RT?RPA?LFD檢測，檢測時間短，結果可用肉眼判讀，更加方便，實現了對待檢樣品的快速檢測，并且靈敏度高，特異性好，最低檢測限為10supgt;?8/supgt;ng/μL。

技術領域

本發明屬于病毒檢測技術領域，具體涉及檢測獼猴桃褪綠環斑病毒的引物對、引物組、試劑盒及方法。

背景技術

獼猴桃是全球重要的園藝產品之一，因其果肉含有豐富的維生素C、礦物質及膳食纖維，深受大眾的青睞。病害的侵染會影響獼猴桃的產量和質量，甚至影響獼猴桃產業的健康發展。獼猴桃褪綠環斑病毒(Actinidia?chlorotic?ringspot-associated?virus，AcCRaV)是一種特異性侵染獼猴桃的病毒，該病毒在獼猴桃產區普遍發生，且通常和其它病毒復合侵染。獼猴桃在感染AcCRaV時，常表現出葉片褪綠、斑駁和環斑等癥狀，嚴重影響獼猴桃的產量和品質。

果樹病毒的檢測是病毒病害預測、預報及防治的關鍵環節。目前報道的AcCRaV檢測方法主要是逆轉錄PCR(Reverse?transcription-PCR，RT-PCR)，該檢測方法需要經過樣品采集，研磨，RNA提取，反轉錄，PCR，電泳等過程，且需配置PCR儀，電泳儀，凝膠成像儀等專業設備，過程相對繁瑣且費錢費時費工；此外，由于RT-PCR的靈敏度有限，在檢測病毒含量較低的材料時容易出現假陰性的結果。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種檢測獼猴桃褪綠環斑病毒的引物對、引物組、試劑盒及方法，提高獼猴桃褪綠環斑病毒檢測的靈敏性、特異性和檢測速度。

為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

本發明提供了一種利用RPA檢測獼猴桃褪綠環斑病毒的引物對，包括序列為SEQID?NO.1所示的上游引物RPA-AcCRaV-F和序列為SEQ?ID?NO.2所示的下游引物RPA-AcCRaV-R。

本發明還提供了一種利用RPA-LFD檢測獼猴桃褪綠環斑病毒的引物組，包括序列為SEQ?ID?NO.1所示的上游引物RPA-AcCRaV-F、序列為SEQ?ID?NO.2所示的下游引物RPA-AcCRaV-R和序列為SEQ?ID?NO.3所示的探針AcCRaV-nfo-probe。

優選的，所述探針AcCRaV-nfo-probe中的Y被[THF]替換，所述探針AcCRaV-nfo-probe的5’端添加FITC標記，3’端添加聚合酶擴增阻斷基團。

本發明還提供了一種利用RPA-LFD檢測獼猴桃褪綠環斑病毒的檢測試劑盒，包括上述技術方案所述的引物組、反應緩沖液和陽性對照。

優選的，還包括逆轉錄試劑、核酸提取試劑和RNase抑制劑。

本發明還提供了一種基于RT-RPA-LFD檢測獼猴桃褪綠環斑病毒的方法，包括如下步驟：

提取含有獼猴桃褪綠環斑病毒的待測樣品的總RNA；

利用上述技術方案所述引物組對總RNA進行RT-RPA反應，得RPA產物；

利用測流層析試紙條對所述RPA產物進行檢測，判斷獼猴桃待檢測樣品是否含有獼猴桃褪綠環斑病毒。