[發(fā)明專利]高活性Tn5轉(zhuǎn)座酶突變體

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210833604.9
• 申請日: 2022-05-10
• 公開（公告）號: CN116286713A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋東亮;唐瓊衛(wèi);劉想
• 申請（專利權(quán)）人: 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12
• 代理公司: 蘇州根號專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32276
• 代理人: 朱華慶

本發(fā)明公開了一種高活性Tn5轉(zhuǎn)座酶突變體，對如SEQ?ID?No.3所示的野生型Tn5轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列的位點進行突變，獲得R26W、E54K、R62P、D156K、L372P五位點突變的突變體，將該突變體命名為Mut轉(zhuǎn)座酶，其序列如SEQ?ID?No.4所示。本發(fā)明的高活性Tn5轉(zhuǎn)座酶突變體與野生型Tn5轉(zhuǎn)座酶相比，其活性顯著提高。

本申請為申請?zhí)枮?02210500786.8，申請日為2022年5月10日，發(fā)明名稱為“快速鑒定Tn5轉(zhuǎn)座酶活性的方法”的分案申請。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高活性Tn5轉(zhuǎn)座酶突變體，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

Tn5轉(zhuǎn)座酶現(xiàn)已作為一種重要的工具應(yīng)用于高通量測序技術(shù)，但轉(zhuǎn)座酶的活性測定方法限制了酶的高通量優(yōu)化篩選和穩(wěn)定生產(chǎn)。目前轉(zhuǎn)座酶的活性測定主要包括三種：第一種是基于轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)報告基因(抗性基因或毒蛋白)插入基因組的原理，最終通過平板單克隆計數(shù)來間接確定轉(zhuǎn)座酶的相對活性，實驗組與對照組克隆數(shù)差異越大則轉(zhuǎn)座酶活性越強。這種方法雖然全面考量了轉(zhuǎn)座時“剪切與粘貼”兩個過程，但最終單克隆數(shù)量即酶活的確定將受轉(zhuǎn)化率與細胞狀態(tài)的影響，測定結(jié)果存在較大誤差。另外，由于工作量大、步驟繁瑣，此種方法很難實現(xiàn)通量篩選測試。

第二種方法依賴于轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的猝滅基團與熒光基團的解離，通過熒光信號相對強弱判定酶活強弱。相比于第一種方法，其可大幅度減少測定誤差獲得重復(fù)性較好的酶活結(jié)果，但測活過程需要使用特定試劑及儀器。且由于在體外測活，需要將表達后的轉(zhuǎn)座酶純化，不適用于大規(guī)模突變體庫的篩選和酶活測試。

第三種方法直接比對不同轉(zhuǎn)座酶建庫的質(zhì)量，以文庫的覆蓋度指示酶活的強弱；或以接頭引物的PCR產(chǎn)物濃度為標(biāo)準(zhǔn)，評估新的轉(zhuǎn)座酶突變體的活性。此法測定的活性可直接與下游應(yīng)用關(guān)聯(lián)，但酶活測定所耗費時間及物料成本極高，尤其在開展大量篩選工作時性價比較低。而且，建庫反應(yīng)需要較高純度的酶，對純化工藝的要求更高，同樣不適用于高通量的篩選。

因此，開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確的酶活相對定量方法迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種高活性Tn5轉(zhuǎn)座酶突變體，對如SEQ?ID?No.3所示的野生型Tn5轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列的位點進行突變，獲得R26W、E54K、R62P、D156K、L372P五位點突變的突變體，將該突變體命名為Mut轉(zhuǎn)座酶，其序列如SEQ?ID?No.4所示。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種快速鑒定Tn5轉(zhuǎn)座酶活性的方法，其步驟為：

(1)構(gòu)建報告基因表達質(zhì)粒以及Tn5轉(zhuǎn)座酶表達質(zhì)粒，所述報告基因表達質(zhì)粒為熒光蛋白表達質(zhì)粒，報告基因表達質(zhì)粒復(fù)制子為與pBR322復(fù)制子兼容的大腸桿菌復(fù)制子，報告基因表達質(zhì)粒的啟動子為可誘導(dǎo)型啟動子，在啟動子兩側(cè)加裝有被Tn5轉(zhuǎn)座酶特異性識別的序列；

(2)報告基因表達質(zhì)粒和Tn5轉(zhuǎn)座酶表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到表達細胞中，構(gòu)建雙質(zhì)粒報告系統(tǒng)；

(3)誘導(dǎo)Tn5轉(zhuǎn)座酶表達；

(4)誘導(dǎo)報告基因表達；

(5)檢測報告基因表達水平，確定轉(zhuǎn)座酶的相對活性。

優(yōu)選的，所述報告基因表達質(zhì)粒中的熒光蛋白為紅色、綠色或藍色熒光蛋白；報告基因表達質(zhì)粒復(fù)制子為p15A復(fù)制子；報告基因表達質(zhì)粒啟動子為P_lac、P_BAD或P_tet，Tn5轉(zhuǎn)座酶特異性識別的序列為IE、OE或ME。

優(yōu)選的，所述Tn5轉(zhuǎn)座酶表達質(zhì)粒為表達Tn5轉(zhuǎn)座酶的pET系列質(zhì)粒。

優(yōu)選的，所述Tn5轉(zhuǎn)座酶表達質(zhì)粒為pET21b(+)質(zhì)粒。

優(yōu)選的，所述表達細胞為大腸桿菌細胞。