[發明專利]高活性Tn5轉座酶突變體

在審

• 申請號: 202210833604.9
• 申請日: 2022-05-10
• 公開（公告）號: CN116286713A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 宋東亮;唐瓊衛;劉想
• 申請（專利權）人: 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12
• 代理公司: 蘇州根號專利代理事務所(普通合伙) 32276
• 代理人: 朱華慶

本發明公開了一種高活性Tn5轉座酶突變體，對如SEQ?ID?No.3所示的野生型Tn5轉座酶的氨基酸序列的位點進行突變，獲得R26W、E54K、R62P、D156K、L372P五位點突變的突變體，將該突變體命名為Mut轉座酶，其序列如SEQ?ID?No.4所示。本發明的高活性Tn5轉座酶突變體與野生型Tn5轉座酶相比，其活性顯著提高。

本申請為申請號為202210500786.8，申請日為2022年5月10日，發明名稱為“快速鑒定Tn5轉座酶活性的方法”的分案申請。

技術領域

本發明涉及一種高活性Tn5轉座酶突變體，屬于生物工程技術領域。

背景技術

Tn5轉座酶現已作為一種重要的工具應用于高通量測序技術，但轉座酶的活性測定方法限制了酶的高通量優化篩選和穩定生產。目前轉座酶的活性測定主要包括三種：第一種是基于轉座酶介導報告基因(抗性基因或毒蛋白)插入基因組的原理，最終通過平板單克隆計數來間接確定轉座酶的相對活性，實驗組與對照組克隆數差異越大則轉座酶活性越強。這種方法雖然全面考量了轉座時“剪切與粘貼”兩個過程，但最終單克隆數量即酶活的確定將受轉化率與細胞狀態的影響，測定結果存在較大誤差。另外，由于工作量大、步驟繁瑣，此種方法很難實現通量篩選測試。

第二種方法依賴于轉座酶介導的猝滅基團與熒光基團的解離，通過熒光信號相對強弱判定酶活強弱。相比于第一種方法，其可大幅度減少測定誤差獲得重復性較好的酶活結果，但測活過程需要使用特定試劑及儀器。且由于在體外測活，需要將表達后的轉座酶純化，不適用于大規模突變體庫的篩選和酶活測試。

第三種方法直接比對不同轉座酶建庫的質量，以文庫的覆蓋度指示酶活的強弱；或以接頭引物的PCR產物濃度為標準，評估新的轉座酶突變體的活性。此法測定的活性可直接與下游應用關聯，但酶活測定所耗費時間及物料成本極高，尤其在開展大量篩選工作時性價比較低。而且，建庫反應需要較高純度的酶，對純化工藝的要求更高，同樣不適用于高通量的篩選。

因此，開發一種快速、準確的酶活相對定量方法迫在眉睫。

發明內容

本發明提供了一種高活性Tn5轉座酶突變體，對如SEQ?ID?No.3所示的野生型Tn5轉座酶的氨基酸序列的位點進行突變，獲得R26W、E54K、R62P、D156K、L372P五位點突變的突變體，將該突變體命名為Mut轉座酶，其序列如SEQ?ID?No.4所示。

本發明采用的技術方案為：一種快速鑒定Tn5轉座酶活性的方法，其步驟為：

(1)構建報告基因表達質粒以及Tn5轉座酶表達質粒，所述報告基因表達質粒為熒光蛋白表達質粒，報告基因表達質粒復制子為與pBR322復制子兼容的大腸桿菌復制子，報告基因表達質粒的啟動子為可誘導型啟動子，在啟動子兩側加裝有被Tn5轉座酶特異性識別的序列；

(2)報告基因表達質粒和Tn5轉座酶表達質粒共轉染到表達細胞中，構建雙質粒報告系統；

(3)誘導Tn5轉座酶表達；

(4)誘導報告基因表達；

(5)檢測報告基因表達水平，確定轉座酶的相對活性。

優選的，所述報告基因表達質粒中的熒光蛋白為紅色、綠色或藍色熒光蛋白；報告基因表達質粒復制子為p15A復制子；報告基因表達質粒啟動子為P_lac、P_BAD或P_tet，Tn5轉座酶特異性識別的序列為IE、OE或ME。

優選的，所述Tn5轉座酶表達質粒為表達Tn5轉座酶的pET系列質粒。

優選的，所述Tn5轉座酶表達質粒為pET21b(+)質粒。

優選的，所述表達細胞為大腸桿菌細胞。