[發明專利]一株根瘤菌的分離鑒定和促進甘蔗生長的研究方法

在審

• 申請號: 202210826474.6
• 申請日: 2022-07-13
• 公開（公告）號: CN115181670A
• 公開（公告）日: 2022-10-14
• 發明（設計）人: 林麗;黃冬梅
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區農業科學院
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12N1/20;C12Q1/689;C12Q1/06;A01G31/00;A01G22/55;A01G7/06;A01G24/15;A01G24/10;C12R1/41
• 代理公司: 濟南市新圖新夏天專利代理事務所(普通合伙) 37330
• 代理人: 潘燦標

本發明涉及甘蔗種植研究技術領域，尤其涉及一株根瘤菌的分離鑒定和促進甘蔗生長的研究方法。其主要針對現有技術中根瘤菌在甘蔗中應用的詳細研究方案欠缺等問題，提出如下技術方案：步驟一：采樣；步驟二：分離細菌；步驟三：鑒定細菌；步驟四：細菌內生性檢測；步驟五：研究CZGRD1在不同基因型甘蔗體內的定殖組織模式；步驟六：利用¹⁵N同位素稀釋技術檢測聯合固氮。本發明提出的根瘤菌促進甘蔗苗生長和根瘤菌能與甘蔗聯合固氮的研究，為甘蔗的低氮高效種植提供理論依據，并結合實際運用，有利于提高甘蔗的產量等特性，有利于促進甘蔗低氮種植的發展，主要應用于根瘤菌對甘蔗種植的影響技術。

技術領域

本發明涉及甘蔗種植研究技術領域，尤其涉及一株根瘤菌的分離鑒定和促進甘蔗生長的研究方法。

背景技術

甘蔗為禾本科植物，為我國南方各地常見有栽培植物。具有清熱生津，潤燥和中，解毒之功效。根瘤菌在根內定居，植物供給根瘤菌以礦物養料和能源，根瘤菌固定大氣中游離氮氣，為植物提供氮素養料，兩者在拮抗寄生關系中處于均衡狀態而表現共生現象。根瘤菌是一類廣泛分布于土壤中的革蘭氏陰性細菌，與豆科植物共生，通過侵染豆科植物根部形成根瘤并固定空氣中的氮氣供植物營養的一類桿狀細菌。根瘤菌與豆科植物的共生是生物固氮體系中作用最強的體系，所固定的氮約占生物固氮總量的65％。在農業生產和固氮生態體系中起著極其重要的作用。

甘蔗的生長發育，大致可分為幼苗期、發糵期、莖節伸長期3個階段；甘蔗在幼苗期以前，主要依靠甘蔗種貯藏的營養，不用向外吸收養分；甘蔗到了發蘗期，會不斷地分蘗發枝，而枝葉生長，正需要氮肥；甘蔗到了莖節伸長期，莖桿會長高長粗，葉片會長得寬厚，底下的根系也會長得粗壯。這時是甘蔗生長發育的關鍵時期，需要大量的氮元素；縱觀甘蔗的生長全期，需要氮肥最多。

根瘤菌具備優異的固氮功效，而甘蔗生長周期中對氮肥的需求量也較高，但是在現有技術中，根瘤菌接種技術在豆科作物種植中應用較為廣泛，卻鮮有根瘤菌在甘蔗(禾本科植物)中應用的詳細研究方案，讓非豆科作物通過生物固氮滿足作物生長發育的氮素營養需求是生物學研究和農業科技的一個重要目標。鑒于此，我們提出一株根瘤菌的分離鑒定和促進甘蔗生長的研究方法。

發明內容

本發明的目的是針對背景技術中存在的現有技術中根瘤菌在甘蔗中應用的詳細研究方案欠缺等的問題，提出一株根瘤菌的分離鑒定和促進甘蔗生長的研究方法。

本發明的技術方案：一株根瘤菌的分離鑒定和促進甘蔗生長的研究方法，包括以下研究處理步驟：

步驟一：采樣；取野外旱坡地割手密的根，存放在塑封袋中，目的用于分離根瘤菌菌；

步驟二：分離細菌；取步驟一中割手密根沖洗清除附著的泥土，取每株割手密植株的鮮根5g，經由處理后研磨成勻漿，勻漿液稀釋處理后鋪在無氮的YMA培養基上，經由特定的培養環境長出迗單菌落在YMA培養基上劃線培養3次純化菌株；

步驟三：鑒定細菌；用引物799f/1492r(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/GGTTACCTTGTTACGACTT)擴增各固氮菌的16SrDNA片段(約735bp),測序鑒定細菌的歸屬；

步驟四：根瘤菌內生性檢測；篩選出的根瘤菌以約每毫升培養基含約1*10⁵活細菌的量與甘蔗組培苗在無植物激素和維生素的1/10MS基本培養液中培養，并對培養后的蔗苗處理后分離蔗苗的根和地上苗，浸入無菌磷酸緩沖鹽液中研磨勻漿；勻漿液用磷酸緩沖鹽液10倍系列稀釋，各取100μl鋪在培養基上；待菌落長成，計數根瘤菌在蔗苗內的數量，評估根瘤菌的內生定殖能力；

步驟五：研究根瘤菌CZGRD1在不同基因型甘蔗體內的定殖組織模式；將甘蔗組培苗的整條根切成幾段制備觀察樣本，結合共聚焦顯微鏡和透射電鏡觀察掃描；