[發(fā)明專利]一種產(chǎn)β-欖香烯的工程菌及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210818797.0
• 申請(qǐng)日: 2022-07-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115975893A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝恬;殷曉浦;諶容;王銘;劉雨恒;陳姝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12P5/00;C12R1/19
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 朱亞冠

本發(fā)明公開(kāi)一種產(chǎn)β?欖香烯的工程菌及應(yīng)用。本發(fā)明提供的重組菌，為在宿主大腸桿菌BL21(DE3)star中表達(dá)IPP和DMAPP生物合成途徑相關(guān)酶基因以及法尼基焦磷酸合成酶，萵苣來(lái)源的吉馬烯A合成酶基因突變體；該重組菌在SBMSN培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后可以獲得吉馬烯A前體，經(jīng)高溫轉(zhuǎn)化后生成β?欖香烯，時(shí)間產(chǎn)率達(dá)到目前報(bào)道的最高水平，為β?欖香烯的生物合成方面提供可用的菌株。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種產(chǎn)β-欖香烯的工程菌及應(yīng)用，特別涉及一種萵苣來(lái)源的吉馬烯A合成酶及其突變株的制備及在β-欖香烯的高效生物合成。

背景技術(shù)

β-欖香烯是從傳統(tǒng)中藥溫郁金中分離出的一種倍半萜類成分，因其抗腫瘤活性強(qiáng)、作用范圍廣、毒副作用輕微及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)而具有廣泛的應(yīng)用前景。目前β-欖香烯的獲取主要依靠從溫郁金中分離提取，但傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式分離純化難度大、得率低且成本高，嚴(yán)重阻礙了β-欖香烯的大規(guī)模生產(chǎn)與應(yīng)用。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，利用微生物構(gòu)建細(xì)胞工廠生物合成天然藥物成為研究熱點(diǎn)，也為β-欖香烯的生產(chǎn)提供了新的思路。

β-欖香烯是一種倍半萜烯，屬于倍半萜類大家族。一般來(lái)說(shuō)，植物來(lái)源的倍半萜以異戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)作為基本的結(jié)構(gòu)元件。IPP和DMAPP在植物中主要通過(guò)甲羥戊酸途徑(MVA)和甲基赤蘚糖醇4-磷酸途徑(MEP)進(jìn)行合成。1分子IPP和1分子DMAPP在異戊烯轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，頭尾縮合生成香葉基焦磷酸(GPP)，GPP再與1分子IPP縮合生成—法尼基焦磷酸(FPP)，后者在吉馬烯A合成酶的作用下生成吉馬烯A，進(jìn)一步發(fā)生Cope重排，生成β-欖香烯。目前，在酵母細(xì)胞中可構(gòu)建了吉馬烯A的生物合成途徑，可用于β-欖香烯的生產(chǎn)。但由于酵母細(xì)胞發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，最短約72小時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到309.8mg/L，時(shí)空產(chǎn)率為4.20mg/L.h。張等人構(gòu)建的酵母工程菌誘導(dǎo)培養(yǎng)144小時(shí)后，產(chǎn)量達(dá)到469mg/L，時(shí)空產(chǎn)率為3.26mg/L.h。

目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道中的β-欖香烯的生物合成多在釀酒酵母中進(jìn)行，目前還未見(jiàn)在大腸桿菌中進(jìn)行β-欖香烯全生物合成的報(bào)道，而大腸桿菌由于生長(zhǎng)迅速，遺傳操作簡(jiǎn)單，發(fā)酵方法簡(jiǎn)單成熟，用于中藥活性成分的生物全合成具有很大的優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種重組菌，為體內(nèi)含有或表達(dá)異戊烯基焦磷酸IPP和二甲基烯丙基焦磷酸DMAPP生物合成途徑相關(guān)酶基因以及法尼基焦磷酸合成酶，萵苣來(lái)源的吉馬烯A合成酶基因突變體。

作為優(yōu)選，所述萵苣來(lái)源的吉馬烯A合成酶基因的編碼基因的核苷酸序列為SEQ.ID?NO.1所示。所述萵苣來(lái)源的吉馬烯A合成酶的氨基酸序列為SEQ.ID?NO.2所示。

作為優(yōu)選，所述萵苣來(lái)源的吉馬烯A合成酶突變體是將萵苣來(lái)源的吉馬烯A合成酶BL21氨基酸序列中第229位、第243位、第364位、第392位、第410位中至少一個(gè)進(jìn)行定點(diǎn)突變。其中第364位的I突變?yōu)镵，第410位的T突變?yōu)镾，第392位的T突變?yōu)锳，第392位的T突變?yōu)閂，第229位的A突變?yōu)镾，第243位的S突變?yōu)镹；

作為優(yōu)選，所述萵苣來(lái)源的吉馬烯A合成酶突變體是將萵苣來(lái)源的吉馬烯A合成酶氨基酸序列中第364位的I突變?yōu)镵和第410位的T突變?yōu)镾。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種重組基因工程菌，其特征在于由萵苣來(lái)源的吉馬烯A合成酶編碼基因構(gòu)建的重組載體、pBbA5c-MM重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)star中得到；

所述萵苣來(lái)源的吉馬烯A合成酶編碼基因構(gòu)建的重組載體由萵苣來(lái)源的吉馬烯A合成酶突變體與pET28a載體連接得到。

作為優(yōu)選，所述萵苣來(lái)源的吉馬烯A合成酶基因的編碼基因的核苷酸序列為SEQ.ID?NO.1所示。所述萵苣來(lái)源的吉馬烯A合成酶的氨基酸序列為SEQ.ID?NO.2所示。