[發明專利]一種5’瓣狀核酸酶介導的等溫擴增方法

在審

• 申請號: 202210813606.1
• 申請日: 2022-07-12
• 公開（公告）號: CN116064745A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 李靜;張璐璐;查洋;陳銀薩;蔣廣志;陳金薩
• 申請（專利權）人: 上海宏序生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848
• 代理公司: 上海灃成知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 31425
• 代理人: 徐洋洋

本發明是一種等溫擴增方法，利用Taq酶的5’瓣狀核酸內切酶的特性，釋放出互補配對的適配子；適配子之間互補擴增補齊缺口；全長適配子解鏈后的單鏈可識別體系中環裝質粒目的區域，在等溫擴增酶的作用下進行等溫擴增；本方法包括引物組、適配子序列、探針序列、外源環狀質粒；所用酶包括taq酶、Bst酶等，本發明優點在于：減少引物對，降低設計難度；2.特異性高，假陽性率低；3.設計簡單，可規模化檢測；方便拓展應用范疇。

技術領域

本發明涉及核酸等溫擴增領域，具體涉及利用Taq酶的5’瓣狀核酸內切酶等溫擴增領域。

背景技術

近年來分子生物學技術有了迅猛的發展，為了適應不同環境、不同樣本及不同目的的檢測需求，多種等溫擴增方法應運而生。其中，環介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermal?amplification，LAMP)和交叉引物等溫擴增技術(Crossing?PrimingAmplification，CPA)是其中應用最廣的兩種方案。LAMP擴增流程如圖1所示；CAP具體擴增流程如圖2所示。

目前等溫擴增技術存在兩個問題：1.引物設計難：上述方法需要設計至少3對引物才能完成擴增，考慮到引物的特異性、長度、Tm值等因素，對上述等溫擴增方法引物的設計就變得比較難。另外由于DNA重復序列、GC含量高區域等因素的存在，不是所有的位點都可以采用上述兩種方案進行擴增。2.假陽性高：由于等溫擴增極強的敏感性，反應環境中若是存在污染或引物有非特異的擴增，極易產生假陽性結果，對檢測造成誤判。

發明內容

發明目的：提供一種設計簡單、特異性靈敏度高、假陽性低的等溫擴增方法，以解決現有技術引物設計復雜、假陽性率高的問題。

技術方案：一種等溫擴增方法，利用Taq酶的5’瓣狀核酸內切酶(FEN1，flapendonuclease1)的特性，釋放出互補配對的適配子。適配子之間互補擴增補齊缺口。全長適配子解鏈后的單鏈可識別體系中環裝質粒目的區域，在等溫擴增酶的作用下進行等溫擴增。

本方法包括引物組、適配子序列、探針序列、外源環狀質粒；所用酶包括taq酶、Bst酶等。

整個方法步驟如下：

步驟A設計引物集合

針對目的基因設計引物，引物包含兩對，分別為A/B和C/D。

A/B為外側雙向引物，引物長度為10-60nt，最佳為18-24nt，用于錨定目的基因。擴增子長度不限，以100bp-1Kb為佳。A/B結構可以無特殊修飾，也可以增加部分修飾以達到提高特異性、穩定引物結構的目的，例如硫代修飾等。A/B引物序列與外源質粒無識別區域。

C/D為內側雙向引物，一方面對目的基因進行進一步錨定以提高特異性，另一方面，C/D引物5’端分別為探針PC/PD序列，用于后續釋放探針識別外源質粒；3’端為目的基因錨定引物C’和D’，用于對目的基因的識別和退火。C/D引物在實際反應中可以是一對，也可以是多對。C/D結構圖示如圖3所示。

C’/D’識別區域位于A/B引物對的擴增范圍內，引物長度為10-60nt，最佳為18-24nt；

C’/D’引物序列與外源質粒無識別區域，特別是3’端無識別區域；

C’/D’可以無特殊修飾，也可以增加部分修飾以達到提高特異性、穩定引物結構的目的，例如硫代修飾等；

C’/D’可以3’端1-5個堿基與目的基因不同，達到阻斷延伸的作用，最佳為2-3個；

C’/D’可以3’端加入雙脫氧胞嘧啶修飾，達到阻斷延伸的作用；

探針PC包括兩部分序列，外源質粒識別序列C1和適配子序列1；

探針PD包括兩部分序列，外源質粒識別序列D1和適配子序列2；