[發(fā)明專利]一種烏蘇里貉成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210803916.5
• 申請日: 2022-07-07
• 公開（公告）號: CN115161269B
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李鑫;李偉;任二軍;劉潔;鄧露芳;劉進(jìn)軍;宗文麗;王朋然;郭亮;韓學(xué)良;趙春付
• 申請（專利權(quán)）人: 石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院;北京三元種業(yè)科技股份有限公司飼料分公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;A01N1/02
• 代理公司: 河北國維致遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 13137
• 代理人: 張新利

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體公開一種烏蘇里貉成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。所述烏蘇里貉成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法包括樣品采集、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、細(xì)胞凍存以及細(xì)胞復(fù)蘇過程。本發(fā)明提供的烏蘇里貉成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法能夠獲得高純度、高活率的烏蘇里貉耳緣組織成纖維細(xì)胞，且分離培養(yǎng)過程中成纖維細(xì)胞易貼壁生長以及消化脫壁，只需2次傳代就可將成纖維細(xì)胞分離純化。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種烏蘇里貉成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

烏蘇里貉，隸屬于食肉目犬科貉屬，主要用于生產(chǎn)毛皮，是制作高檔大衣、皮領(lǐng)、皮帽等裘皮制品的優(yōu)質(zhì)原料，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

烏蘇里貉是我國特有的優(yōu)秀毛皮動(dòng)物種質(zhì)資源，具有地方品種遺傳多樣性的特點(diǎn)。隨著工業(yè)化城鎮(zhèn)化進(jìn)程加快、氣候環(huán)境變化以及畜牧業(yè)生產(chǎn)方式的轉(zhuǎn)變，畜禽種質(zhì)資源群體數(shù)量和區(qū)域分布發(fā)生很大變化，地方品種消失風(fēng)險(xiǎn)加劇，一旦消失滅絕，其蘊(yùn)含的優(yōu)異基因、承載的傳統(tǒng)農(nóng)耕文化也將隨之消亡，生物多樣性也將受到影響，種質(zhì)資源保存工作已成當(dāng)務(wù)之急。因此，隨著體外培養(yǎng)技術(shù)和體細(xì)胞克隆技術(shù)的發(fā)展，體細(xì)胞保存等方法已成為畜禽種質(zhì)資源保存的理想方法和途徑，分離培養(yǎng)烏蘇里貉成纖維細(xì)胞對于解決研究材料的問題十分必要。畜禽基因資源的體細(xì)胞保存作為一種安全、穩(wěn)定的體外保存方法，不僅能夠在細(xì)胞水平上將畜禽基因資源長期保存下來，還能為從細(xì)胞和分子水平開展遺傳學(xué)、生物學(xué)研究提供寶貴的試驗(yàn)材料。但目前的烏蘇里貉成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)的烏蘇里貉成纖維細(xì)胞存在純度和活率低、需要的傳代次數(shù)多、不易貼壁生長以及貼壁生長的細(xì)胞不易消化脫壁的問題，致使烏蘇里貉基因資源的體細(xì)胞不能安全、穩(wěn)定的保存。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有烏蘇里貉成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法存在的上述問題，本發(fā)明提供一種烏蘇里貉成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，該烏蘇里貉成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法能夠獲得高純度、高活率的烏蘇里貉耳緣組織成纖維細(xì)胞，且分離培養(yǎng)過程中成纖維細(xì)胞易貼壁生長以及消化脫壁，只需2次傳代就可將成纖維細(xì)胞分離純化。

為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例采用了如下的技術(shù)方案：

一種烏蘇里貉成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

a、以活體烏蘇里貉為采集對象，對其耳部進(jìn)行去毛和消毒，然后剪下0.5cm²-1.5cm²的耳緣組織，消毒、清洗，保存?zhèn)溆茫凰銮逑此玫那逑匆簽楹?00IU/mL青霉素和500IU/mL鏈霉素的FBS高糖DMEM，所述FBS高糖DMEM中FBS的體積含量為8-12％；所述保存所用的保存液為含3-4g/L的HEPES、100IU/mL的青霉素和100IU/mL鏈霉素的FBS高糖DMEM；所述FBS高糖DMEM中FBS的體積含量為8-12％；

b、將所述耳緣組織放入裝有dispaseⅡ消化液的離心管中進(jìn)行消化，取出所述耳緣組織，去除表皮，剪碎，得到耳緣組織碎片；將所述耳緣組織碎片置于原代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待所述耳緣組織碎片完全貼壁后，每間隔2d-3d天更換一次原代培養(yǎng)基，待所述耳緣組織碎片周圍長出新細(xì)胞，即為原代細(xì)胞；

c、當(dāng)所述原代細(xì)胞生長至匯合度達(dá)到80％-90％時(shí)，用PBS清洗，并加入胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化，所述胰蛋白酶消化液的加入量為耳緣組織碎片體積的3-5倍，當(dāng)所述原代細(xì)胞由纖維狀變?yōu)榍驙顣r(shí)，加入傳代培養(yǎng)基終止消化并混勻，得到細(xì)胞懸浮液；將所述細(xì)胞懸浮液加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，進(jìn)行第一次傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后吸出培養(yǎng)液，并加入新的傳代培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度到達(dá)80％-90％，進(jìn)行下一次傳代培養(yǎng)；經(jīng)過2-3次傳代培養(yǎng)后，得到純化后的烏蘇里貉耳緣組織成纖維細(xì)胞；

d、向所述純化后的烏蘇里貉耳緣組織成纖維細(xì)胞中加入凍存液，進(jìn)行細(xì)胞凍存，所述細(xì)胞凍存液的配制方法為：將DMSO、FBS和高糖DMEM按照1:7-9:0.8-1.2的體積比混合后，加入蔗糖，使所述蔗糖在所述細(xì)胞凍存液中的濃度達(dá)到65-70g/L；