[發(fā)明專利]一種快速檢測(cè)人外周血Her2基因擴(kuò)增的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210776918.X
• 申請(qǐng)日: 2022-07-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115044659A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-09-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周勇;邱燕;嚴(yán)君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): C12Q1/686
• 分類號(hào): C12Q1/686
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)人外周血Her2基因擴(kuò)增的方法。本發(fā)明基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)中g(shù)RNA在dcas9的引導(dǎo)下可與特定DNA序列結(jié)合的原理，設(shè)計(jì)靶向Her2基因和LAF4基因的探針gRNA序列，將標(biāo)記上不同熒光的gRNA探針與dcas9蛋白反應(yīng)結(jié)合，組成探針體系，通過(guò)酶標(biāo)儀顯示Her2基因與內(nèi)參基因的熒光值結(jié)果，實(shí)現(xiàn)對(duì)人外周血Her2基因擴(kuò)增的快速檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性好、快速、經(jīng)濟(jì)、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，可用于通過(guò)血液ctDNA檢測(cè)進(jìn)行乳腺癌輔助診斷，臨床以及預(yù)后等多個(gè)研究領(lǐng)域。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及 Her2基因擴(kuò)增檢測(cè)的方法。

背景技術(shù)

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率分別位列我國(guó)女性惡性腫瘤的第1位和第4位。中國(guó)每年新發(fā)乳腺癌26.9萬(wàn)例，死亡7.0萬(wàn)例，45-59歲女性為高發(fā)年齡段人群，中位年齡為50歲。2021年1月初，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)發(fā)布了2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)顯示，2020年，女性乳腺癌新增人數(shù)達(dá)226萬(wàn)，首次超過(guò)肺癌，成為全球第一大癌癥，約占新發(fā)癌癥病例的11.7%

Her2基因即人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（Human Epidermal Growth FactorReceptor 2）基因，Her2位于17號(hào)染色體，主要編碼Her2蛋白。Her2蛋白是一種跨膜糖蛋白，在細(xì)胞增殖、分化、血管生成等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其高表達(dá)可加速細(xì)胞分裂，使其增殖、分化過(guò)程失衡，最終轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞。此外，有研究發(fā)現(xiàn)Her2高表達(dá)可增加腫瘤細(xì)胞的遷移率、體外侵襲率和Ⅳ型膠原酶活性，且可干擾黏附分子合成，從而促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

目前，在醫(yī)學(xué)診斷上，Her2基因是診斷乳腺癌的關(guān)鍵基因標(biāo)記物，Her2基因擴(kuò)增陽(yáng)性或過(guò)表達(dá)的乳腺癌患者在治療模式與其他類型的乳腺癌患者有很大的區(qū)別，是靶向用藥的重要依據(jù)，研究顯示，在Her2基因陽(yáng)性的乳腺癌婦女中，赫賽汀作為單藥治療、聯(lián)用標(biāo)準(zhǔn)化療或在標(biāo)準(zhǔn)化療后使用，均可以提高治療效果。同樣Her2也可以作為肺腺癌、結(jié)腸癌等的診斷指標(biāo)，而且對(duì)于后期治療有很重要的指導(dǎo)意義。

CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，是對(duì)靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)，CRISPR-Cas9是基因組調(diào)控技術(shù)中靈活性最強(qiáng)的系統(tǒng)之一。Cas9 的核酸酶剪切活性取決于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域RuvC 和HNH，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別負(fù)責(zé)切割 DNA鏈的兩條鏈，并且這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域能夠單獨(dú)地被人工點(diǎn)突變失活。當(dāng) RuvC 和HNH 同時(shí)處于失活狀態(tài)時(shí)(D10A＆H840A; RuvC-＆HNH-)，Cas9將不具有核酸酶活性，成為 dCas9(deadCas9) ，dCas9 雖然沒(méi)有剪切 DNA 的能力，但仍可以在 gRNA 的引導(dǎo)下與特定DNA序列結(jié)合,在微量DNA靶標(biāo)的檢出上具備快速、便捷、特異性好、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)。

目前，臨床上檢測(cè)Her2擴(kuò)增的常用檢測(cè)方法有免疫組化（IHC）、熒光原位雜交（FISH）、熒光定量PCR（qPCR）和測(cè)序（NGS）。IHC是基于抗體在蛋白水平上的檢測(cè)手段，雖已被廣泛應(yīng)用，但受組織固定、抗原修復(fù)、一抗的靈敏度和特異度、染色結(jié)果評(píng)定等多種因素的影響，尤其對(duì)Her2輕、中度表達(dá)的樣本造成假陰性；FISH是基于探針直接在DNA水平上的檢測(cè)，是病理檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)，但FISH對(duì)探針制備的要求很高，存在檢測(cè)周期長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)室條件的限制；另一方面，IHC和FISH通常需要獲得病理組織，取樣方式給病人造成了一定的痛苦和傷害。另有研究顯示，人外周血中可檢測(cè)到與乳腺癌細(xì)胞一致的基因擴(kuò)增，但常用的qPCR檢測(cè)手段針對(duì)人外周血循環(huán)腫瘤DNA此類微量樣本，檢測(cè)結(jié)果不夠靈敏；NGS雖然結(jié)果相對(duì)比較準(zhǔn)確，但是檢測(cè)成本較高，造成大量病患得不到及時(shí)準(zhǔn)確的診斷而失去個(gè)體化用藥的機(jī)會(huì)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問(wèn)題，提出了本發(fā)明，以便提供一種克服上述問(wèn)題或者至少部分地解決上述問(wèn)題的用于外周血中Her2基因擴(kuò)增的快速檢測(cè)方法及試劑盒。