[發明專利]一種拜耳威利格單加氧酶突變體及其應用

在審

• 申請號: 202210773030.0
• 申請日: 2022-06-30
• 公開（公告）號: CN115305265A
• 公開（公告）日: 2022-11-08
• 發明（設計）人: 王萍;朱露;孟梟;周丹;李杰;孫豐來;朱景仰;劉超;代丹梅;文湘輝
• 申請（專利權）人: 上海合全藥物研發有限公司;上海合全藥業股份有限公司
• 主分類號: C12P11/00
• 分類號: C12P11/00;C12P41/00;C12N9/02;C12N15/53
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 陳卓

1.一種手性亞砜類化合物的制備方法，其特征在于，其包含以下步驟：在單加氧酶突變體的存在下，將化合物1進行單加氧反應，得到手性亞砜類化合物即可；

其中，*表示對應硫原子的手性為S構型或者R構型；

R₁為H、Me、MeO、F、Cl或I；

所述單加氧酶突變體為在如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列上具有選自以下一個或多個位點的氨基酸殘基的差異：

第3位、第14位、第34位、第43位、第71位、第111位、第141位、第143位、第144位、第149位、第174位、第209位、第240位、第246位、第248位、第277位、第288位、第307位、第326位、第327位、第341位、第383位、第386位、第388位、第390位、第400位、第415位、第426位、第432位、第433位、第434位、第435位、第438位、第448位、第449位、第464位、第481位、第488位、第489位、第490位、第505位、第516位、第526位、第537位和第540位。

2.如權利要求1所述制備方法，其特征在于，其滿足下述條件的一個或多個：

(1)所述單加氧反應的反應溶劑為緩沖液、或、緩沖液和有機溶劑的混合物；所述有機溶劑優選選自醚類溶劑、環氧類溶劑、酯類溶劑、亞砜類溶劑、酰胺類溶劑和醇類溶劑中的一種或多種；所述醚類溶劑可選自甲基叔丁基醚、異丙醚、四氫呋喃和2-甲基四氫呋喃中的一種或多種；所述環氧類溶劑可為1,4-二氧六環；所述酯類溶劑可為乙酸乙酯；所述亞砜類溶劑可為二甲基亞砜；所述酰胺類溶劑可為N,N-二甲基甲酰胺；所述醇類溶劑可選自甲醇、乙醇、異丙醇和正丁醇中的一種或多種；所述緩沖液可選自硼酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三羥甲基甲胺鹽緩沖液和三乙醇胺鹽緩沖液中的一種或多種；

(2)當所述單加氧反應的反應溶劑為緩沖液和有機溶劑的混合物時，所述有機溶劑與所述緩沖液的體積比為(0.01-0.5):1；

(3)所述單加氧酶突變體與所述化合物1的質量比為(0.01～1):1；

(4)所述制備方法進一步包含氧化劑，所述氧化劑優選為含氧氣體；

(5)所述制備方法進一步包含氫供體，所述氫供體優選為NADPH，或NADP⁺和異丙醇；

(6)所述制備方法中進一步包含氧化還原酶，所述氧化還原酶優選為KRED；

(7)所述制備方法進一步包含過氧化氫酶；

(8)所述單加氧反應的反應溫度為25℃～50℃；

(9)所述單加氧反應的反應時間為16～24h；

(10)所述單加氧反應的pH值為6.0～10.5；

(11)所述手性亞砜類化合物的制備方法，其包括以下步驟：向所述反應溶劑中，加入所述化合物1和所述單加氧酶突變體，混合均勻后在25℃～50℃下反應即可；

(12)所述單加氧反應結束后，通過以下步驟進行后處理，其包含：萃取，濃縮；

(13)所述差異為缺失、增加或替換，優選為替換；和

(14)所述單加氧酶突變體為在如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第3位氨基酸殘基替換為A、F、G、H、K、L、M、S、T或V，和/或，第14位氨基酸殘基替換為A、C、D、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第34位氨基酸殘基替換為C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V、W或Y，和/或，第43位氨基酸殘基替換為C、F、G、H、I、K、L、M、P、R、V、W或Y，和/或，第71位氨基酸殘基替換為A、D、G、H、I、K、M、P、Q、R、S、T、V或Y，和/或，第111位氨基酸殘基替換為C、E、F、G、I、K、M、N、P、R、S、T、V、W或Y，和/或，第141位氨基酸殘基替換為A、D、E、G、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第143位氨基酸殘基替換為A、C、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T或W，和/或，第144位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、V或W，和/或，第149位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V或W，和/或，第174位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、V、W或Y，和/或，第209位氨基酸殘基替換為C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y，和/或，第240位氨基酸殘基替換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V或Y，和/或，第246位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第248位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、R、S、T、V或Y，和/或，第277位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第288位氨基酸殘基替換為C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第307位氨基酸殘基替換為D、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第326位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、F、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第327位氨基酸殘基替換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y，和/或，第341位氨基酸殘基替換為A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第383位氨基酸殘基替換為C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、S、T、W或Y，和/或，第386位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、F、H、I、K、M、P、R、S、T、V、W或Y，和/或，第388位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y，和/或，第390位氨基酸殘基替換為A、C、E、F、G、H、I、K、L、N、P、R、S、T、V、W或Y，和/或，第400位氨基酸殘基替換為A、C、D、F、H、I、K、L、N、P、Q、S、T、V或W，和/或，第415位氨基酸殘基替換為A、C、E、F、G、I、K、L、M、N、R、S、W或Y，和/或，第426位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、R、S、T、V或W，和/或，第432位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、S、V或Y，和/或，第433位氨基酸殘基替換為C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、V或Y，和/或，第434位氨基酸殘基替換為A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、V、W或Y，和/或，第435位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、F、G、I、K、N、Q、R、S、V、W或Y，和/或，第438位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、Q、R、T、V、W或Y，和/或，第448位氨基酸殘基替換為F、H、K、L、R、S、V或Y，和/或，第449位氨基酸殘基替換為C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y，和/或，第464位氨基酸殘基替換為A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、V或Y，和/或，第481位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、G、H、K、L、N、P、Q、R、S、T、V或W，和/或，第488位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、S、T、V、W或Y，和/或，第489位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W或Y，和/或，第490位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y，和/或，第505位氨基酸殘基替換為A、C、D、E、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第516位氨基酸殘基替換為C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第526位氨基酸殘基替換為C、F、G、K、S、V或Y，和/或，第537位氨基酸殘基替換為D、H、K、L、M、R、S、T或W，和/或，第540位氨基酸殘基替換為D、K、L、M、N、Q、S或W。