[發(fā)明專利]一種滑石粉金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210761197.5
• 申請(qǐng)日: 2022-06-30
• 公開（公告）號(hào): CN115029419A
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 崔大祥;李雪玲;田靜;仲禺俊;沈琦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海納米技術(shù)及應(yīng)用國家工程研究中心有限公司;國納納米技術(shù)研究（河北）有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6844
• 分類號(hào): C12Q1/6844;C12Q1/689;C12N15/11;C12R1/445
• 代理公司: 上海東亞專利商標(biāo)代理有限公司 31208
• 代理人: 董梅

1.一種滑石粉金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）滑石粉取樣；

（2）樣品稀釋：

（3）在增菌液中增菌；

（4）提取基因組DNA，包括但不限于為CTAB法、酸裂解法、堿裂解法以及商業(yè)試劑盒法；

（5）以基因組DNA為模板，以能擴(kuò)增金黃色葡萄球菌基因組特異性堿基序列的引物組為引物，在等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，所述等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系包括聚合酶反應(yīng)緩沖液，Mg²⁺，dNTP，引物組Bst DNA聚合酶、石蠟塊中的一種或多種；

（6）擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)方法包括但不限于電泳檢測(cè)、濁度檢測(cè)或顯色檢測(cè)中的一種，通過判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽性，確定待測(cè)樣品中是否存在金黃色葡萄球菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滑石粉金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的取樣為，每批滑石粉應(yīng)隨機(jī)抽兩個(gè)或兩個(gè)以上包裝完好的單位，試樣量不少于10g。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滑石粉金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的樣品稀釋為稱取10.0g試樣，放入裝入90mL稀釋劑和玻璃珠的容器中，混勻制成1：10稀釋液，所述的稀釋劑為氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的滑石粉金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，其特征在于，氯化鈉-蛋白胨緩沖液的配方為：蛋白胨20g、氯化鈉5g和蒸餾水1000mL，將各組分加熱溶解后，調(diào)pH值為7.0-7.2，在121℃高壓滅菌15min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滑石粉金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的增菌為取上述1：10稀釋液10mL放入裝有增菌液的容器中，36℃±1℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，其中，所述增菌液為細(xì)菌培養(yǎng)液。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滑石粉金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的細(xì)菌培養(yǎng)液包括：7.5%氯化鈉肉湯、10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯、NB培養(yǎng)液、LB培養(yǎng)液。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的滑石粉金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的7.5%氯化鈉肉湯的配方為：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化鈉75g、蒸餾水1000mL，將各組分加熱溶解后，調(diào)pH值為7.2-7.4，在121℃高壓滅菌15min。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滑石粉金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系為：1× Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺（MgSO₄或MgCl₂），1.0-1.6mmol/L dNTP， 0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶、0-1.5mol/L甜菜堿，在25μL的核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系中石蠟塊融化后的體積為8μl優(yōu)化體系。

9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的滑石粉金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的能擴(kuò)增金黃色葡萄球菌基因組特異性堿基序列的引物組為：

F3：5’- TAAAGCCACATCCAATATAG -3’ （SEQ ID NO：1）；

B3：5’- TGCCTTACATTGATGCTG -3’ （SEQ ID NO：2）；

FIP：5’- GTCGTTGGTGAGCAATTGAGGAGTATCGTTCCAGATTTGTGA -3’； （SEQ ID NO：3）；

BIP：5’- CGACTAGGGGTAGTAATCATTGGCCACTTTGCTATGGAACGTAAC -3’ （SEQ ID NO：4）。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滑石粉金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)棰?5℃孵育60min；②80℃終止反應(yīng)5min。