[發明專利]斑馬魚心臟發育相關基因簇缺失突變體中主效基因的篩選方法和應用

在審

• 申請號: 202210760738.2
• 申請日: 2022-06-30
• 公開（公告）號: CN114934075A
• 公開（公告）日: 2022-08-23
• 發明（設計）人: 祖堯;王冰琦
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;C12N15/12;C12N15/113;C12N9/22;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 曹莉

1.斑馬魚心臟發育相關基因簇缺失突變體中主效基因的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、確定斑馬魚hoxbb基因簇中hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b和hoxb8b四個基因的靶點位置并分別設計靶點gRNA序列；

S2、分別設計并合成上述四個靶點的gRNA上游引物和gRNA下游引物；

S3、以gRNA骨架質粒為模板，分別使用上述gRNA上游引物和gRNA下游引物進行PCR擴增；

S4、對步驟S3的PCR產物進行體外轉錄，純化獲得hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b和hoxb8b的gRNA；

S5、上述純化后的gRNA和Cas9 mRNA分別顯微注射到單細胞的斑馬魚胚胎中，24h后提取DNA進行T7E1酶檢測；

S6、待斑馬魚性成熟后，將存在突變的斑馬魚與野生型斑馬魚雜交，得到hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b、hoxb8b基因型的雜合子F₁，將雜合子F₁成魚連接轉化后鑒定基因型，性成熟后的F₁進行交配，得到純合突變體；

S7、對hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b和hoxb8b基因成功敲除的后代顯微成像，并進行單基因鑒定，根據不同單位點缺失的純合突變體對應的圖像篩選具有明顯表型的基因；

S8、對斑馬魚分別在10hpf、14hpf和18hpf單細胞測序結果分析，篩選在早期心臟發育存在明顯表達的基因，同時結合hoxbb簇中hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b和hoxb8b單基因的原位雜交表達情況，與步驟S7的結果相互對照篩選hoxbb簇中的主效基因，其為hoxb1b。

2.根據權利要求1所述斑馬魚心臟發育相關基因簇缺失突變體中主效基因的篩選方法，其特征在于，步驟S1中，hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b和hoxb8b基因的靶點gRNA序列分別如SEQ ID NO:1–4所示。

3.根據權利要求1所述斑馬魚心臟發育相關基因簇缺失突變體中主效基因的篩選方法，其特征在于，步驟S2中，gRNA上游引物為T7+Target site+gRNA正向引物，分別為序列如SEQ ID NO:5–8所示的引物T7-hoxb1b-sfd、T7-hoxb5b-sfd、T7-hoxb6b-sfd和T7-hoxb8b-sfd，gRNA下游引物的序列如SEQ ID NO:9所示。

4.根據權利要求1所述斑馬魚心臟發育相關基因簇缺失突變體中主效基因的篩選方法，其特征在于，步驟S4中，hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b和hoxb8b的gRNA的序列分別如SEQ IDNO:11–14所示。

5.根據權利要求1所述斑馬魚心臟發育相關基因簇缺失突變體中主效基因的篩選方法，其特征在于，步驟S5中，所述T7E1酶檢測采用的檢測引物包括序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的上游引物hoxb1b-F和下游引物hoxb1b-R、如SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:18所示的上游引物hoxb5b-F和下游引物hoxb5b-R、如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的上游引物hoxb6b-F和下游引物hoxb6b-R以及如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的上游引物hoxb8b-F和下游引物hoxb8b-R。

6.根據權利要求1所述斑馬魚心臟發育相關基因簇缺失突變體中主效基因的篩選方法，其特征在于，步驟S8中，利用單細胞測序結果分析靶基因結合探針hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b和hoxb8b的斑馬魚整胚原位雜交，對hoxbb基因簇中hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b和hoxb8b四個基因在心臟祖細胞區域的表達情況進行對比和相互驗證，篩選在心臟祖細胞區域有表達且表現出和hoxbb基因簇缺失后相似的心臟發育異常表型基因，確定為關鍵基因hoxb1b。