[發(fā)明專利]一種豬用串聯(lián)乙肝核心病毒樣顆粒的制備方法

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• 申請日: 2022-06-29
• 公開（公告）號: CN115010815A
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 叢彥龍;秦佳儀;孫藝學(xué);張鵬舉;邸海洋;韓金宏
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/22;C07K1/34;C07K1/36;C12N15/70;C12N15/66;C12N15/62
• 代理公司: 深圳市洪荒之力專利代理有限公司 44541
• 代理人: 謝艷紅

1.一種豬用串聯(lián)乙肝核心病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：設(shè)計(jì)并合成重組豬傳染性胃腸炎病毒表面刺突蛋白A、D抗原表位的乙型肝炎病毒衣殼蛋白基因，即HBT/AD，以乙型肝炎病毒流行毒株CAPSD_HBVD1為參考株，選取其衣殼蛋白作為骨架，將截短單體與全長單體串聯(lián)，并在截短單體的MIR區(qū)中插入串聯(lián)的豬傳染性胃腸炎病毒W(wǎng)H_1株的A、D表位，各部分之間用GS linker連接，在所構(gòu)建基因的N端加SacⅠ，C端加HindⅢ酶切位點(diǎn)；

步驟2：基因工程構(gòu)建重組質(zhì)粒，將HBT/AD基因克隆至原核表達(dá)載體pET-28b(+)，PCR、雙酶切鑒定正確后的重組質(zhì)粒命名pET-28b-HBT/AD(+)；

步驟3：重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定，將pET-28b-HBT/AD(+)轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主Escherichia coli BL21 DE3(Rosetta)感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)并取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析，鑒定表達(dá)的菌液經(jīng)超聲破碎細(xì)胞分離上清和沉淀，SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)形式；

步驟4：重組蛋白的大量表達(dá)及純化，活化工程菌并大量誘導(dǎo)，離心后菌體用含6M尿素的緩沖液重懸并超聲，以鎳柱純化蛋白；

步驟5：包涵體蛋白的復(fù)性，BCA法測定純化后的蛋白濃度，以相同組分的緩沖液稀釋蛋白至0.4mg/mL，裝入截留分子量8～14kDa的透析袋中，按4M、2M、1M以及0M的尿素濃度進(jìn)行梯度透析復(fù)性；

步驟6：VLP-HBT/AD的獲得，復(fù)性后的HBT/AD蛋白能自發(fā)組裝成乙肝核心病毒樣顆粒，將步驟5中的透析袋包埋在PEG-4000粉末中，待蛋白濃縮至稀釋前體積即可獲得純化的VLP-HBT/AD。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬用串聯(lián)乙肝核心病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，A表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，D表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬用串聯(lián)乙肝核心病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，HBT/AD蛋白的核苷酸基序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的豬用串聯(lián)乙肝核心病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，HBT/AD基因的引物序列為：

上游引物HBT/AD-F：5′-cgagctcgatggatataga-3′；

下游引物HBT/AD-R：5′-ccaagcttttaacattggc-3′。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬用串聯(lián)乙肝核心病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，所述步驟2的具體步驟如下：

步驟2.1：按照現(xiàn)有技術(shù)，分別用Sac I和Hind III對步驟1中合成獲得的HBT/AD基因進(jìn)行雙酶切并回收酶切產(chǎn)物，利用T4 DNA連接酶將上述酶切產(chǎn)物與pET-28b(+)質(zhì)粒進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化至Escherichia coli BL21 DE3(Rosetta)感受態(tài)細(xì)胞中；

步驟2.2：對所篩選的陽性菌落進(jìn)行擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，采用PCR鑒定及酶切驗(yàn)證，以檢測HBT/AD基因是否正確重組至pET-28b(+)載體中。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬用串聯(lián)乙肝核心病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，在所述步驟2.1中，利用T4 DNA連接酶將上述酶切產(chǎn)物與pET-28b(+)質(zhì)粒進(jìn)行連接的連接體系為：基因酶切產(chǎn)物4μL；pET-28b(+)載體酶切產(chǎn)物1μL；5×Buffer 2μL；T4 DNA連接酶0.5μL；ddH₂O 2.5μL；25℃連接2h后，16℃過夜連接。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬用串聯(lián)乙肝核心病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，在所述步驟2.1中，將連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化至Escherichia coli BL21 DE3(Rosetta)感受態(tài)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化過程為：將10μL連接產(chǎn)物加入50μL感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴3min，42℃熱激45s，再冰浴5min后加入1mL無抗LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm培養(yǎng)40min，隨后涂布于卡那抗性選擇培養(yǎng)基并篩選陽性菌落。