[發明專利]一種通過光鑷捕獲膜納米管內的轉運顆粒實時測定馬達蛋白力學參數的方法

在審

• 申請號: 202210756086.5
• 申請日: 2022-06-29
• 公開（公告）號: CN115046976A
• 公開（公告）日: 2022-09-13
• 發明（設計）人: 唐宏武;徐大地;李江濤;劉瀏;鄭婭雯
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N21/84;G01N15/10
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 李煒

本發明提供了一種通過光鑷捕獲膜納米管內的轉運顆粒實時測定馬達蛋白力學參數的方法。本發明以量子點、染料和熒光蛋白作為熒光標記物，對膜納米管內顆粒及微絲、微管和馬達蛋白分別進行標記。通過單顆粒示蹤技術，對膜納米管內顆粒及相關馬達蛋白轉運過程進行實時成像，并使用光鑷對正在轉運的目標顆粒進行捕獲并測定其力譜信息，實現對膜納米管內驅動顆粒運動的馬達蛋白的力學參數的實時測定。本方法不僅通過共聚焦快速熒光成像的方式對小于光學衍射極限的顆粒進行示蹤，而且在示蹤的基礎上采用光鑷準確捕獲該顆粒物。本發明可廣泛應用于生物領域，研究細胞間通過膜納米管轉運物質的力學機制和信息。

技術領域

本發明屬于光鑷操縱技術領域，也屬于單顆粒示蹤技術領域，其包含生物物理、分子生物學、納米生物技術和光學成像等交叉技術領域。

背景技術

光鑷最早于1986年被美國科學家Ashkin發明，它是由一束高斯光束經過透鏡聚焦后產生的激光束，與光阱附近的粒子產生兩種作用力。一種沿著光傳播方向運動的力叫做散射力，另一種沿著光場梯度方向，將微粒推向光場梯度最強位置的力叫做梯度力。當梯度力遠大于散射力時，微粒將被牢牢束縛在光阱中心附近。光鑷相較于其他測力方式具有遠距離、無接觸、無損傷等優點。光鑷力的模型根據其顆粒粒徑大小分為幾何光學模型、電磁模型與米氏模型，如果光鑷捕獲的粒子尺寸遠遠小于激光波長，則為瑞利粒子，適用的受力模型為電磁模型。在用無機發光材料如量子點對顆粒進行熒光標記時，可以在保證生物活性的同時增加折射率與極化率，從而增加對顆粒捕獲的穩定性。

單顆粒示蹤是一種通過熒光顯微鏡實時、原位研究活細胞內生物動態發生過程的強大工具。目前，單顆粒示蹤技術已在細胞膜的結構功能，分子馬達運輸機制、病毒侵染宿主細胞機制等領域得到廣泛應用。通過對單顆粒的時間和空間上的檢測并通過軟件進行分析，可以揭示病毒侵染的機制和條件。同時，還可以通過這種方式在膜納米管內轉運貨物時，對其顆粒和馬達蛋白進行動態示蹤，從而深入了解驅動膜納米管內貨物轉運的力學機制。

膜納米管(MNTs)是一種長的膜狀肌動蛋白延伸，將一個細胞連接到另一個細胞，以允許在兩個連接的細胞之間交換細胞器和信號分子?？稍诓溉閯游锛毎g的長距離內保持膜連續性，代表了細胞間通訊的新生物學原理。膜納米管不同于眾所周知的絲狀偽足，因為它們更長(長度可達幾個細胞直徑)，并且懸浮在細胞培養基中而不附著在基底上。最近的研究表明膜納米管可轉運病毒、量子點、細胞器等物質，而其中的貨物在膜納米管內轉運主要由肌動蛋白(myosin)、驅動蛋白(kinesin)或動力蛋白(dynein)等馬達蛋白驅動貨物沿著微絲或微管運動?，F有關于胞外馬達蛋白的力學信息以及運動機制有了一定的研究，但在活細胞內某些馬達蛋白的力學信息和細胞外有較大的差別，這是由于細胞內的細胞質、細胞核和多種細胞器都會對馬達蛋白的轉運造成很大的影響。

目前尚缺乏一種可實現細胞內實時準確測定馬達蛋白力學參數，并可進一步獲取馬達蛋白力學機制的方法。

發明內容

針對現有的研究對于膜納米管內物質的轉運行為和膜納米管內馬達蛋白的工作機制還不清楚，有可能涉及幾種不同的行進性線性分子馬達參與其中的問題，本發明將單顆粒示蹤技術和光鑷技術相結合，研究膜納米管內顆粒的轉運過程的受力信息進而反映馬達蛋白的力學機制。因此，本發明提供一種將光鑷與共聚焦快速熒光成像相結合測定膜納米管內顆粒轉運過程中馬達蛋白力學參數的方法，通過光鑷捕獲膜納米管內的轉運顆粒，可以實時準確測定馬達蛋白的力學參數，并進一步獲取馬達蛋白的力學機制。

本發明提供的技術方案如下：

一種通過光鑷捕獲膜納米管內的轉運顆粒實時測定馬達蛋白力學參數的方法，包括如下步驟：

(1)對宿主細胞的微絲、微管和馬達蛋白進行熒光標記；

(2)選用通過量子點或熒光染料修飾的粒子作為轉運顆粒；

(3)調節宿主細胞的密度控制細胞間膜納米管的生成，顯微鏡明場下觀察細胞間的膜納米管的位置；