[發明專利]用于檢測H4亞型禽流感病毒的特異性引物和探針及其應用

在審

• 申請號: 202210754426.0
• 申請日: 2022-06-28
• 公開（公告）號: CN115125333A
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 葉春生;吳淑江;董大陸;吳丹娜;吳海波;楊帆
• 申請（專利權）人: 杭州博拓生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 朱瑩瑩

1.檢測H4亞型禽流感病毒的特異性引物和探針，其特征在于，

所述特異性引物為H4-F和H4-R，如SEQ ID NO：1-2所示：

H4-F的序列信息：5’-GACCCARGGATACAAGGACA-3’，

H4-R的序列信息：5’-AAATGCAAATCTGGCACC-3’；

探針為H4-P，如SEQ ID NO：3所示：

H4-P的序列信息：5’-TTGTGGGCTTGTC-3’。

2.如權利要求1所述的檢測H4亞型禽流感病毒的特異性引物和探針，其特征在于，H4-P的5’端進行報告熒光染料Cy5標記，3’端進行熒光淬滅基團MGB標記。

3.檢測H4亞型禽流感病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1或2所述的特異性引物和探針。

4.如權利要求3所述的檢測H4亞型禽流感病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于：所述的特異性引物和探針濃度均為10微摩爾。

5.如權利要求3所述的檢測H4亞型禽流感病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于，試劑盒還包括一步法熒光定量PCR反應緩沖液、一步法熒光定量PCR反應混合酶和無核酸酶水。

6.如權利要求6所述的檢測H4亞型禽流感病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于，試劑盒包括10微升一步法熒光定量PCR反應緩沖液、1微升一步法熒光定量PCR反應混合酶、0.5微升10微摩爾的H4-F、0.5微升10微摩爾的H4-R、0.5微升10微摩爾的H4-P、2微升模板、5.5微升無核酸酶水，總反應體系為20微升，其中模板為陽性對照、陰性對照或待檢樣本。

7.如權利要求6所述的檢測H4亞型禽流感病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于，試劑盒的熒光定量RT-PCR反應擴增條件：第一階段，反轉錄：55攝氏度，15分鐘；第二階段，預變性：95攝氏度，30秒；第三階段，PCR擴增：95攝氏度，5秒；60攝氏度，34秒，40個循環，每次循環第三階段60攝氏度擴增后采集熒光信號，選擇熒光通道Cy5。

8.權利要求3-7所述的檢測H4亞型禽流感病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒的使用方法，包括如下步驟：

1)利用核酸提取試劑從待測樣本中提取RNA；

2)利用檢測試劑盒中提供的引物與探針、一步法熒光定量PCR反應緩沖液、一步法熒光定量PCR反應混合酶和無核酸酶水進行熒光定量RT-PCR反應，擴增核酸；

3)熒光定量RT-PCR反應擴增條件：第一階段，反轉錄：55攝氏度，15分鐘；第二階段，預變性：95攝氏度，30秒；第三階段，PCR擴增：95攝氏度，5秒；60攝氏度，34秒，40個循環，每次循環第三階段60攝氏度擴增后采集熒光信號，選擇熒光通道Cy5；

4)根據Ct值判斷熒光定量RT-PCR檢測結果，判定樣品中是否含有H4亞型禽流感病毒。

9.權利要求3-7所述的檢測H4亞型禽流感病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒用于快速鑒定H4亞型禽流感病毒的應用。

10.如權利要求9所述的應用，所述試劑盒用于體液、尿囊液或其他環境樣本中的檢測。