[發明專利]一種基于受體-抗體夾心的Cry毒素檢測方法

在審

• 申請號: 202210751409.1
• 申請日: 2022-06-28
• 公開（公告）號: CN115128281A
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 劉賢金;沈成;劉媛;胡曉丹;高美靜;林曼曼;張霄;徐重新
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/31
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 楊文晰

本發明涉及一種基于受體?抗體夾心的Cry毒素檢測方法，包括：1)將棉鈴蟲鈣黏蛋白毒素結合區片段稀釋后包被過夜2)次日加入封閉液反應；3)加入待測樣品反應；4)加入Cry2Aa、Cry1Ab兔多克隆抗體反應；5)加入HRP標記的羊抗兔抗體反應；6)加入顯色液反應；7)加入終止液，測定OD₄₅₀值，帶入標準線性方程即可獲得Cry毒素的殘留量；上述方法利用HaCad?TBR作為捕獲抗體，可同時檢測Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa、Cry2Ab四種毒素，且靈敏度高，可用于農產品新鮮葉片和谷物中殘留的Cry毒素蛋白殘留量檢測和類型分析研究。

技術領域

本發明屬于免疫學技術領域，特別是一種用于蘇云金芽孢桿菌Cry毒素(包括Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa、Cry2Ab)檢測的“受體-抗體”檢測方法。

背景技術

1981年Yamamoto和McLaughlin首次從蘇云金芽孢桿菌kurstaki亞種的伴孢晶體中分離得到分子量分別為130kDa(P1)和66k Da(P2)兩個殺蟲蛋白組分，其中P1蛋白(Cry1類毒素)對鱗翅目害蟲具有毒性，而P2蛋白(Cry2類毒素)對鱗翅目和雙翅目害蟲均有毒性。近幾十年來，全球轉基因作物面積顯著增加，自第一個轉基因番茄以來，發展中國家和發達國家種植了1.8億公頃。然而，由于轉基因作物對環境和人類健康具有潛在風險，導致轉基因作物并未被廣泛接受。因此，有必要通過使用現場、快速和可靠的方法對食品材料進行識別、量化和信息收集來創建轉基因商品的監督和監控。

雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)是Cry毒素檢測分析的常用方法之一，通常基于兔多克隆抗體(PAbs)、單克隆抗體(mAbs)、單鏈可變片段(scFv)或駝源納米抗體等進行檢測。然而，傳統單克隆抗體的制備需要一個復雜的程序，單鏈抗體或駝源納米抗體通常在制備過程中也十分繁瑣，且這些抗體的產量低、不穩定，檢測成本高。同時由于抗體對Cry毒素具有特異性識別作用，傳統的單克隆抗體或兔多克隆抗體建立的雙抗夾心檢測方法只能特異性檢測某一種Cry毒素，不具有廣譜性，不能同時檢測多種Cry毒素(如Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa、Cry2Ab等)，對于存在多種毒素殘留的農產品的檢測費用高，且難覆蓋多種Cry毒素的檢測，進一步限制了對轉基因作物種Cry毒素的檢測。

Gao等人在研究Cry1A類和Cry2A類毒素的功能受體時，發現異源表達的棉鈴蟲鈣黏蛋白(HaCad-TBR)毒素結合區片段與部分Cry毒素具有一定的結合能力，但該研究最終的結果顯示棉鈴蟲鈣黏蛋白受體并非是Cry1類和Cry2類的功能受體，未涉及任何檢測性質的實驗。

同時，目前研究報道中Cry毒素的潛在功能受體眾多，如類鈣黏蛋白(CAD)、氨肽酶N(APN)、堿性磷酸酯酶(ALP)以及ATP結合盒式轉運蛋白(ABC)家族等靶潛在功能受體；且不同種類的Cry毒素在其功能受體上差異較大，同一種毒素對不同昆蟲的作用受體也不相同，因此在確定昆蟲受體片段上十分繁瑣，相較于傳統ELISA檢測制備一個單克隆抗體，確定一個能夠用于廣譜性檢測的昆蟲受體更加困難。目前，利用HaCad-TBR技術檢測多種Cry毒素的方法尚未見報道。

發明內容

針對上述問題，本申請以棉鈴蟲鈣黏蛋白毒素結合區片段(HaCad-TBR)和兩種兔多克隆抗體(Cry1Ab PAbs、Cry2Aa PAbs)為基礎，提供一種全新的Cry毒素檢測方法，能夠一次性同時檢測四種Cry毒素(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa、Cry2Ab)，克服了傳統的雙抗夾心免疫檢測方法一次只能單一檢測某一種Cry毒素的問題。

具體而言，本申請是通過如下技術方案實現的：

首先，本申請提供了一種基于“受體-抗體”夾心的Cry毒素檢測方法，所使用的檢測試劑為棉鈴蟲鈣黏蛋白(HaCad-TBR)毒素結合區片段和兩種兔多克隆抗體(Cry1AbPAbs、Cry2Aa PAbs)，所述Cry毒素包括Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa和Cry2Ab。其具體檢測方法如下：