[發明專利]二化螟GABA受體RDL1亞基A282S突變的分子檢測方法

在審

• 申請號: 202210748999.2
• 申請日: 2022-06-29
• 公開（公告）號: CN115141890A
• 公開（公告）日: 2022-10-04
• 發明（設計）人: 趙春青;張蘇貴;滿文韜;李瑤;羅光華;韓召軍
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;杜靜

本發明公開了一種二化螟GABA受體RDL1亞基A282S突變的分子檢測方法，所述方法為提取單頭二化螟幼蟲基因組DNA；設計兩對特異性引物；建立LAMP反應體系；明確LAMP反應程序；確定反應結果的顏色判定標準。本發明具備特異性強、穩定性好、靈敏度高、操作簡便、用時短等優點，可為田間二化螟的抗藥性監測和抗藥性早期預警提供技術支持，為二化螟的科學防治、合理選藥提供準確的判定標準，更適用于基層植保檢測的需要。本技術旨在解決二化螟GABA受體RDL1亞基A282S突變的快速分子檢測，并由此判斷二化螟是否對苯基吡唑類殺蟲劑產生抗藥性。

技術領域

本發明涉及一種檢測方法，具體涉及一種二化螟GABA受體RDL1亞基A282S突變的分子檢測方法。

背景技術

二化螟Chilo suppressalis(Walker)屬于鱗翅目螟蛾科，是水稻上為害最嚴重的害蟲之一，在世界范圍內均有分布。二化螟是一種鉆蛀型害蟲，幼蟲能夠在水稻的不同發育期鉆蛀莖稈為害，破環植物輸導組織，造成水分和營養流失，導致水稻大幅減產。同時它還危害茭白、玉米、高粱、甘蔗等植物，給我國農業生產造成了嚴重的損失。

長期以來，人們對二化螟的防治主要依賴于化學方法，然而隨著大量的化學農藥長期、連續、不合理的被用于防治二化螟，導致二化螟對多種殺蟲劑產生了不同程度的抗性，使得藥劑的田間防效降低，防治成本逐年提高。有研究表明二化螟已對有機磷類、苯基吡唑類和雙酰胺類等多種類型的殺蟲劑產生了不同程度的抗藥性，并且害蟲對苯基吡唑類殺蟲劑的抗藥性與GABA受體RDL亞基A2’S位點突變密切相關。2014年對我國南方7個地區的二化螟種群進行了抗藥性監測，發現部分地區的二化螟種群已對氟蟲腈和丁烯氟蟲腈等苯基吡唑類殺蟲劑產生了低至中等水平抗性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種二化螟GABA受體RDL1亞基A282S突變的分子檢測方法，通過確定特異性引物、反應溫度條件、結果判定標準等三個主要技術環節，建立二化螟GABA受體RDL1亞基A282S突變的更為便捷準確的基因分子檢測方法。

本發明所述的二化螟GABA受體RDL1亞基A282S突變的分子檢測方法，包括以下步驟：

(1)提取單頭二化螟基因組DNA；

(2)在反應容器中建立LAMP反應體系，包括特異性引物、顯色試劑和LAMP反應液，并補充水；

(3)將反應容器放入加熱容器中加熱反應；

(4)LAMP反應后，含A282S突變的反應溶液的顏色發生明顯變化，不含A282S突變的反應溶液顏色不變。

本發明步驟(1)中提取單頭二化螟基因組DNA是按照本領域的常規方法，在一些實施例中，選擇二化螟幼蟲提取基因組DNA。

進一步地，步驟(2)中，特異性引物包括外引物F3和B3以及內引物FIP和BIP，所述內引物FIP/BIP序列分別為：

FIP:AGACCCGAGCAGGAGTTGCTGATTGTAATCATATCATGGGTATC(SEQ ID NO.1)

BIP:GTTACCACTGTATTGACTATGACTACGTCGATAGATTTCACGTAAG(SEQ ID NO.2)

所述外引物F3/B3序列分別為：

F3:CATCCAAATTTATATTCCATCTGG(SEQ ID NO.3)

B3:CGAAACAGGTGCCCAAAT(SEQ ID NO.4)。

在一些實施例中，外引物終濃度為0.3～0.5μM，內引物終濃度為1.5～1.7μM。

進一步地，步驟(2)中，所述的顯色試劑為羥基萘酚藍(HNB)，HNB的終濃度為140～160μM。