[發明專利]一種含角蛋白酶突變體和膽汁酸的飼料添加劑及其應用

在審

• 申請號: 202210745703.1
• 申請日: 2022-06-29
• 公開（公告）號: CN115074347A
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發明（設計）人: 婁倩倩;曹愛智;張西雷;徐志敏
• 申請（專利權）人: 山東龍昌動物保健品有限公司
• 主分類號: C12N9/54
• 分類號: C12N9/54;C12N15/75;C12N1/21;A61K38/48;A61P3/00;A61P1/12;A23K20/105;A23K20/189;C12R1/125;A61K31/575
• 代理公司: 青島合創知識產權代理事務所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

本發明提供了一種含角蛋白酶突變體和膽汁酸的飼料添加劑及其應用。本發明使用飽和突變方法對Bacillus licheniformis來源的角蛋白酶基因進行突變，獲得角蛋白酶突變體KS01、KS02、KS03、KS04，相比于原始角蛋白酶，突變體最適反應溫度由55℃，分別降低到38℃、45℃、46℃、50℃，并且突變體KS01在25℃至35℃反應條件下，剩余酶活力在65%以上。本發明還利用含突變體的工程菌經發酵、過濾干燥制得的酶制劑與膽汁酸進行復配，不僅其具有很好的酶解豆粕抗原蛋白的效果，而且用于禽畜養殖中，能夠明顯起到防腹瀉作用，并保護動物的腸胃，具有良好的工業價值和市場應用前景。

技術領域

本發明屬于飼料添加劑領域，具體涉及一種含角蛋白酶突變體和膽汁酸的飼料添加劑及其應用。

背景技術

角蛋白酶是一種能夠降解角蛋白類底物(例如角質，皮屑，羽毛等)的特異性角蛋白酶，由真菌、放線菌和細菌等多種微生物以角蛋白為單一碳源生長時產生。角蛋白酶作為一種底物專一性較寬泛，水解催化能力強的蛋白酶，廣泛地運用于日化行業、畜牧行業、飼料行業、制革行業、醫藥行業中，具有巨大的研究與應用價值。角蛋白中其粗蛋白含量在80％以上，各種氨基酸總量在70％以上，動物必需氨基酸種類齊全，同時含有較多大量元素、微量元素和未知生長因子，是一種良好的、可替代或部分替代魚粉的飼料蛋白以及肥料來源，對它的開發利用具有重要的應用前景。目前，野生角蛋白酶大多屬于高溫堿性蛋白酶，其最適反應溫度一般為60℃左右，在20℃-40℃條件下的酶活或者催化活性一般不高。

易錯PCR技術是采用DNA聚合酶在進行PCR反應擴增目的片段的同時，通過調整反應條件，增加基因突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機引入突變，構建突變體文庫，再通過高通量方式篩選需要的正向突變體。易錯PCR技術是蛋白質分子改造中的重要手段。

發明內容

本發明提供了一種含角蛋白酶突變體和膽汁酸的飼料添加劑及其應用。本發明通過隨機突變篩選得到幾種在低溫條件下酶活提高的突變體：KS01、KS02、KS03、KS04，并將其與膽汁酸混合制成飼料添加劑，有效的降低禽畜動物的腹瀉情況，提高其腸道功能。

為了實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案予以實現：

本發明提供了一種角蛋白酶突變體，所述角蛋白酶突變體的氨基酸序列具有如下之一所述的氨基酸序列：

（1）如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

（2）如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；

（3）如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；

（4）如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。

進一步的，所述角蛋白酶突變體具體為由氨基酸序列為SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第340位的絲氨酸變為纈氨酸獲得的角蛋白酶突變體KS01；由氨基酸序列為SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第340位絲氨酸變為谷氨酸獲得的角蛋白酶突變體KS02；由氨基酸序列為SEQID NO：1的角蛋白酶的第340位的絲氨酸變為亮氨酸獲得的角蛋白酶突變體KS03；由氨基酸序列為SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第340位的絲氨酸變為苯丙氨酸獲得的角蛋白酶突變體KS04。

本發明還提供了所述的角蛋白酶突變體的編碼基因，所述編碼基因具有如下之一所述的核苷酸序列：

（1）如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；

（2）如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；

（3）如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；

（4）如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

本發明還提供了包含所述的角蛋白酶突變體的編碼基因的重組表達載體。

本發明還提供了包含所述的角蛋白酶突變體的編碼基因的重組工程菌。