[發明專利]ssc-miR-30c-3p在制備抗PDCoV增殖藥物中的應用

有效

• 申請號: 202210738676.5
• 申請日: 2022-06-24
• 公開（公告）號: CN115161321B
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發明（設計）人: 江珊;李秀麗;鄢明華;王利麗;張莉;任衛科;李程;朱琪;田向學;路超
• 申請（專利權）人: 天津市農業科學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A61K31/7105;A61P31/14
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 齊寶玲

本發明公開了ssc?miR?30c?3p在制備抗PDCoV增殖藥物中的應用。屬于抗病毒藥物技術領域。本發明將增加ssc?miR?30c?3p表達的模擬物和降低ssc?miR?30c?3p表達的抑制劑分別轉染至豬小腸上皮細胞(IPEC?J2)，轉染后24h使用PDCoV感染細胞，感染病毒后12h以熒光定量PCR技術檢測細胞中PDCoV?M基因的表達量，發現PDCoV?M基因的表達量分別顯著減少和升高，表明ssc?miR?30c?3p能夠抑制PDCoV在IPEC?J2細胞中的增殖。本發明為抗PDCoV增殖藥物的制備提供了新的候選miRNA。

技術領域

本發明涉及抗病毒藥物技術領域，更具體的說是涉及ssc-miR-30c-3p在制備抗PDCoV增殖藥物中的應用。

背景技術

豬德爾塔冠狀病毒(Porcine?deltacoronavirus,PDCoV)歸屬于冠狀病毒科、δ冠狀病毒屬，是一種有囊膜的單股、正鏈RNA病毒。該病毒已成為引起豬腹瀉病的主要病原體之一，對養豬業造成了巨大的經濟損失。目前尚無商業化疫苗和特異性藥物用于防治該病毒引發的豬腹瀉病，迫切需要發展新的抗病毒策略。

目前研究者正在從研制抗病毒藥物和疫苗靶標兩個角度積極尋找抑制PDCoV復制的抗病毒分子。

從研發抗病毒藥物角度探索的抗病毒分子多為化合物。羅丹寧衍生物LJ001對PDCoV在ST細胞中的復制具有有效的抑制能力，其能夠限制病毒RNA和蛋白質的合成，并抑制該病毒的復制。膽固醇的氧化產物25-羥基膽固醇能夠通過阻斷PDCoV進入細胞進而抑制該病毒復制。膽汁酸鵝去氧膽酸和石膽酸通過誘導IFN-λ3和IFN刺激基因15(ISG15)的產生抑制PDCoV復制。麥角甾醇過氧化物(EP)在病毒附著、病毒入侵階段對PDCoV的復制均具有抑制活性。此外，褪黑素、熱休克蛋白90抑制劑17-AAG和VER-82576，均在PDCoV復制的早期階段抑制該病毒的復制，凝集素GRFT能夠與PDCoV表面的刺突蛋白結合，通過包裹病毒并阻止其進入細胞抑制該病毒復制，而消化道皮膚素D(GSDMD)通過促進IFN-β的非常規分泌抑制PDCoV復制。

從研發疫苗角度尋找抗病毒分子的報道集中于構建表達病毒基因的shRNA質粒、來自病毒基因組的減毒活病毒疫苗候選基因和病毒樣顆粒(VLP)。基于PDCoV基因組M和N基因構建的shRNA能夠抑制PDCoV在ST細胞中的復制，研究人員進而設計了一種針對N基因的雙shRNA表達質粒，命名為pSil-double-shRNA-N1。NS6蛋白是PDCoV的一個重要毒力因子，為開發減毒活疫苗提供了潛在的候選基因。Zhang等人用綠色熒光蛋白(GFP)替換PDCoV全長感染性cDNA克隆的NS6基因，以生成重組病毒rPDCoV-ΔNS6-GFP。rPDCoV-ΔNS6-GFP在體外和體內均表現出病毒產量下降，并且rPDCoV-ΔNS6-GFP感染仔豬后幾乎未觀察到臨床癥狀或腸道病變。含Qβ噬菌體外殼蛋白的VLP嵌合疫苗具有冠狀病毒的抗原表位，該疫苗可以誘導小鼠體內產生對MHV、PEDV和PDCoV的中和抗體反應。

綜上所述，有待從新的角度進一步探索抑制PDCoV復制的抗病毒分子及相關機制，以豐富用于該病毒疫苗和特異性藥物研發的靶標分子種類。

microRNA(miRNA/miR)是非編碼RNA家族的成員，其在轉錄后水平調控功能基因的表達，廣泛參與多種生物學過程的調控。研究發現，miRNA能夠通過調控宿主細胞天然免疫應答、細胞凋亡、線粒體損傷等途徑實現對多種冠狀病毒增殖的抑制作用，但抑制PDCoV增殖的抗病毒miRNA尚不明確。本發明另辟蹊徑，從miRNA角度為PDCoV的抑制藥物提供候選抗病毒分子。

申請人發現，豬miR-30c-3p(ssc-miR-30c-3p)能夠調節PDCoV在豬小腸上皮細胞(Intestinal?porcine?epithelial?cell?line?J2，IPEC-J2)中的增殖，本發明從新的角度為抗PDCoV增殖藥物的制備提供了候選miRNA。

發明內容