[發明專利]一種利用高效液相色譜測定替奈普酶中精氨酸含量的方法

在審

• 申請號: 202210731737.5
• 申請日: 2022-06-25
• 公開（公告）號: CN115032307A
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發明（設計）人: 張慧君;嚴志軍;張文學;陳太標;花亞東
• 申請（專利權）人: 江蘇豐華生物制藥有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/86
• 代理公司: 江蘇鹽城世拓專利代理事務所(普通合伙) 32526
• 代理人: 陳翠翠

本發明涉及一種利用高效液相色譜測定替奈普酶中精氨酸含量的方法，該方法的色譜條件為：色譜柱：C18；流動相：0.019mol/L庚烷磺酸鈉的0.025mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調節pH值至2.6)?甲醇(80：20)；檢測波長：206mm；柱溫：20～30℃；流速：1.5ml/min；進樣量：20μl。本發明的方法特別適用于測定替奈普酶(TNK?tPA)中精氨酸含量，其無需進行柱前/柱后衍生化，且具有準確度、精密度高、重復性良好、線性范圍寬等特點，為替奈普酶(TNK?tPA)產品制定了一個科學、嚴格的內控標準，提高了替奈普酶(TNK?tPA)產品的質量。

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，尤其是涉及一種利用高效液相色譜測定替奈普酶中精氨酸含量的方法。

背景技術

替奈普酶(TNK-tPA)是迄今為止最安全有效且使用最方便的溶栓藥，目前國內已上市的有第一代重組天然tPA類產品，商品名“愛通立”；第二代為采用大腸桿菌表達的tPA類產品，即瑞替普酶；而替奈普酶(TNK-tPA)是世貿天階制藥(江蘇)有限責任公司生產的第三代tPA類產品，是目前可以單次靜脈推注的溶栓藥品種，其具有一針救命，使用方便的特點，更加適合急救，使得溶栓治療在院外進行成為可能，具有劃時代的意義。

而為了提高替奈普酶(TNK-tPA)的質量標準，需要建立制劑中精氨酸含量的檢驗方法和控制要求。對于原輔料中精氨酸含量的檢測，2020版《中國藥典》中收納的方法為電位滴定法測定精氨酸的含量、采用旋光法測定鹽酸精氨酸注射液中精氨酸的含量，但由于生物制品中精氨酸是作為輔料使用，含量較低，且生物制品中組分較為復雜，輔料之間存在一定影響，因此上述兩種方法不適用于該產品中精氨酸含量測定。

現有技術中亦公開了眾多測定注射制劑中氨基酸的含量的方法，如張彥文，張慶偉利用C18色譜柱測定了腦蛋白水解物注射液中各游離氨基酸的含量《腦蛋白水解物注射液的質量評價》；還有文獻報道采用離子色譜法、氨基鍵合硅膠填充柱對注射制劑中氨基酸的含量進行檢測，但均存在線性范圍窄、圖譜峰型較差、出峰時間短等問題。也有部分報道采用反相柱(C18、C8柱)柱前或柱后衍生化的方法，將其與衍生化實際反應后生成有紫外吸收的物質進行檢測(腦蛋白水解物注射液中氨基酸含量測定分析方法，龔繼華，張澤辛，邱德清)，但是上述方法又存在重復性和準確度不夠，操作繁瑣，檢測設備要求高等缺點。更重要的是，上述方法涉及的均是對多種氨基酸含量的測定，而各個氨基酸之間的性質差異較大，采用上述用于檢測替奈普酶(TNK-tPA)中精氨酸的含量，檢測結果準確度低。

因此，針對上述問題，為了提高替奈普酶(TNK-tPA)制劑的質量，亟需提供一種特別適用于檢測替奈普酶(TNK-tPA)中精氨酸含量的檢測方法，且該方法具有準確度和精密度高、線性范圍寬，重復性良好的特點。

發明內容

本發明的目的在于提供一種可有效解決上述技術問題的利用高效液相色譜測定替奈普酶中精氨酸含量的方法。

為達到本發明之目的，采用如下技術方案：

一種利用高效液相色譜測定替奈普酶中精氨酸含量的方法，包括如下步驟：

A)將替奈普酶供試樣品用水溶解，得樣品溶液；

B)將上述樣品溶液注入高效液相色譜儀；

C)記錄色譜圖，根據外標法計算替奈普酶供試樣品中精氨酸含量。

優選的，所述步驟B)中高效液相色譜儀的色譜條件為：

色譜柱：C18十八烷基硅烷鍵合柱；

流動相：磷酸鹽緩沖液-甲醇；

檢測波長：206mm；

柱溫：20～30℃；

流速：1.35-1.65ml/min；

進樣量：20μl。