[發明專利]豬NLRP6基因啟動子區的雙熒光素酶報告基因載體

有效

• 申請號: 202210728853.1
• 申請日: 2022-06-24
• 公開（公告）號: CN114958918B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發明（設計）人: 馮力;薛美
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所(中國動物衛生與流行病學中心哈爾濱分中心)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N15/66;C12Q1/66;C12N15/113
• 代理公司: 北京維創華成知識產權代理事務所(普通合伙) 16094
• 代理人: 唐利

本發明提供了一種基于豬NLRP6基因啟動子區的雙熒光素酶報告基因載體，屬于基因工程技術領域，將NLRP6基因啟動子連接到pGL3?Basic質粒中，得到雙熒光素酶報告基因載體；所述NLRP6基因啟動子的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1或SEQ?ID?No.2所示。本發明明確了NLRP6基因啟動子在NLRP6基因中的具體位置，將NLRP6基因啟動子連接到pGL3?Basic質粒中，得到雙熒光素酶報告基因載體具有轉錄活性。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其涉及豬NLRP6基因啟動子區的雙熒光素酶報告基因載體。

背景技術

病毒入侵宿主細胞后，首先被宿主模式識別受體(PRRs)所識別。宿主的模式識別受體常見的有Toll樣受體家族(TLRs)、NOD樣受體家族(NLRs)、RIG-I樣受體家族(RLRs)和DNA識別受體等。其中NOD樣受體主要參與炎癥因子的誘導表達等過程，是重要的模式識別受體，與其他幾類受體共同參與調節機體的免疫應答。NLRP6不同于其它NLRs，其呈現組織和細胞特異性表達，在腸道中高表達，在維持腸道微生物穩態和抗細菌免疫方面發揮重要作用。最近研究者用腦心肌炎病毒(EMCV)和鼠諾如病毒(MNV-1)感染模型對其展開研究，發現NLRP6在控制腸道病毒感染方面發揮重要作用。

近年來研究發現NLRP6在黏膜免疫方面發揮重要作用：首先，NLRP6對組織修復至關重要，在野生型小鼠中，腸道損傷可在6天后恢復，但是缺失NLRP6的小鼠腸道損傷難以修復。其次，NLRP6在抗微生物防御方面發揮重要作用。在正常情況下，NLRP6炎性小體調節IL-1β和IL-18的分泌，IL-18維持腸道上皮細胞增殖、抵御微生物感染、通過誘導抗微生物肽和防御素的分泌維持非致病性腸道微生物群，從而維持健康的腸道環境。此外，NLRP6的表達還有助于粘液釋放到腸腔中。因此，在NLRP6缺失的小鼠中，組織修復、腸上皮細胞增殖和抗微生物防御都是受損的，缺乏NLRP6也會影響粘液的產生，進而導致細菌附著增加，并導致更嚴重的炎癥發生。但是現有技術中還未確定NLRP6基因啟動子具體位置。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供豬NLRP6基因啟動子區的雙熒光素酶報告基因載體，本發明能夠明確NLRP6基因啟動子在NLRP6基因中的具體位置。

為了實現上述發明目的，本發明提供了以下技術方案：

本發明提供了一種基于豬NLRP6基因啟動子區的雙熒光素酶報告基因載體，將NLRP6基因啟動子連接到pGL3-Basic質粒中，得到雙熒光素酶報告基因載體；

所述NLRP6基因啟動子的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1或SEQ?ID?No.2所示。

優選的，所述雙熒光素酶為螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶。

本發明還提供了上述技術方案所述的雙熒光素酶報告基因載體的構建方法，包括以下步驟：

1)以豬小腸上皮細胞IPEC-J2全基因組DNA為模板，經PCR擴增，得到NLRP6基因啟動子；

2)將所述步驟1)得到的NLRP6基因啟動子經T4連接酶連接到pGL3-Basic質粒中，得到雙熒光素酶報告基因載體。

優選的，所述步驟1)PCR擴增使用的上游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3或SEQID?No.4所示；

使用的下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.5所示。

優選的，所述PCR擴增的體系每50μL含有2×KOD?Fx?buffer?25μL、2mM?dNTP?10μL、10μM上游引物1.5μL、10μM下游引物1.5μL、KOD?Fx?DNA聚合酶1μL、20ng/μL模板3μL和雙蒸水8μL。