[發(fā)明專利]一株高效生產(chǎn)克拉酸的脂多糖結(jié)構(gòu)截短的大腸桿菌菌株的構(gòu)建

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210724913.2
• 申請(qǐng)日: 2022-06-23
• 公開（公告）號(hào): CN114908031B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王小元;詹依;喬君;胡曉清
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12N15/52;C12N15/54;C12N15/57;C12P19/04;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

本發(fā)明公開了一株高效生產(chǎn)克拉酸的脂多糖結(jié)構(gòu)截短的大腸桿菌菌株的構(gòu)建，屬于基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過在脂多糖截短的大腸桿菌WQM001菌株基礎(chǔ)之上繼續(xù)刪除ackA，rfbB，rfbD，rfbA，rfbC，rfbX，glf，wbbH，wbbI，wbbJ，wbbK以及wbbL基因構(gòu)建得到WZM008菌株。隨后通過構(gòu)建pTrcS質(zhì)粒過表達(dá)uppS基因，并將該質(zhì)粒導(dǎo)入WZM008成功構(gòu)建WZM008/pTrcS重組菌株。WZM008/pTrcS重組菌上罐水平達(dá)到11.68g·Lsupgt;?1/supgt;，是出發(fā)菌株克拉酸產(chǎn)量的3.54倍。且根據(jù)本發(fā)明制備得到的克拉酸，分子量可達(dá)11.4×10supgt;3/supgt;kDa，具備三螺旋結(jié)構(gòu)。本發(fā)明首次探究了代謝途徑改造對(duì)克拉酸生產(chǎn)的影響，為后續(xù)代謝工程改造大腸桿菌構(gòu)建克拉酸高產(chǎn)菌株提供了新思路，同時(shí)對(duì)克拉酸的工業(yè)化生產(chǎn)起到了一定的促進(jìn)作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株高效生產(chǎn)克拉酸的脂多糖結(jié)構(gòu)截短的大腸桿菌菌株的構(gòu)建，屬于基因工程和發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

近年來，細(xì)菌多糖在化妝品行業(yè)、食品領(lǐng)域以及生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊?？死?colanic?acid,CA)是一種細(xì)菌在脅迫環(huán)境下產(chǎn)生的具有保護(hù)性作用的胞外多糖，廣泛存在于腸桿菌屬、沙門氏菌屬、克雷伯氏菌屬以及產(chǎn)氣桿菌屬中?？死嶙鳛橐环N活性生物大分子多糖，具有優(yōu)良的生物學(xué)特性及理化性質(zhì)，可被應(yīng)用于諸多領(lǐng)域。例如克拉酸的疏松多孔結(jié)構(gòu)及大量暴露于表面的親水基團(tuán)，使得克拉酸具備優(yōu)異的持水性能，在食品行業(yè)、化妝品行業(yè)以及醫(yī)療行業(yè)具有極大的應(yīng)用潛力；克拉酸單糖組分中巖藻糖含量較高(30％左右)，這表明克拉酸可能具備抗癌、抗腫瘤以及抗炎癥等生物活性；除以上外，克拉酸及克拉酸單體還被證明具有通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的線粒體動(dòng)力學(xué)從而延緩衰老以及延長(zhǎng)宿主壽命的功能。綜上，克拉酸應(yīng)用前景廣闊，具備較高的生產(chǎn)價(jià)值。

在Escherichia?coli?str.K-12?MG1655菌株中，克拉酸的合成嚴(yán)格受到Rcs磷酸級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的負(fù)調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞面臨環(huán)境脅迫或者包膜應(yīng)激時(shí)，Rcs系統(tǒng)響應(yīng)環(huán)境信號(hào)磷酸化RcsB，磷酸化的RcsB與輔助蛋白R(shí)csA結(jié)合形成異質(zhì)二聚體，激活克拉酸合成基因簇cps(圖1A)。其中輔助蛋白R(shí)csA受到ATP依賴性蛋白酶Lon負(fù)調(diào)控，在高溫時(shí)可被Lon降解。

克拉酸合成主要包括三個(gè)階段：核苷酸糖前體合成階段、克拉酸單體的合成及聚合階段以及轉(zhuǎn)運(yùn)階段(見圖1B)?？死釂误w是由D-半乳糖、L-巖藻糖、D-葡萄糖及D-葡萄糖醛酸以摩爾比2：2：1：1構(gòu)成的六糖單元，輔之以非化學(xué)計(jì)量的乙酰基化以及丙酮基修飾形成。克拉酸單體的合成需要四種核苷酸糖前體，即二磷酸鳥苷巖藻糖(GDP-L-Fuc)，二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-D-Glc)，二磷酸尿苷半乳糖(UDP-D-Gal)和二磷酸尿苷葡萄糖醛酸(UDP-D-GlcA)四種核苷酸糖，其中UDP-D-Glc和UDP-D-Gal可流向LPS合成途徑及O-抗原合成途徑。在四種核苷酸糖的供應(yīng)下，葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶WcaJ將UDP-D-Glc中的1-磷酸葡萄糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移至脂質(zhì)載體十一烯基磷酸酯(Undecaprenyl?phosphate,Und-P)，將六糖重復(fù)單元的生物合成過程錨定在細(xì)胞內(nèi)膜的內(nèi)葉上形成Und-PP-Glc，啟動(dòng)克拉酸的合成。Und-PP-Glc在經(jīng)由WcaI、WcaF、WcaE、WcaC、WcaB、WcaA、WcaL和WcaK的逐步催化后，形成克拉酸重復(fù)單元?？死峤?jīng)WcaD聚合后，經(jīng)由Wza-Wzb-Wzc轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外。

目前關(guān)于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)克拉酸的報(bào)導(dǎo)相對(duì)較少，已發(fā)表的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)克拉酸相關(guān)研究均以大腸桿菌作為生產(chǎn)菌株，且主要集中于解除Rcs系統(tǒng)對(duì)cps基因簇的負(fù)調(diào)控以及維持低pH條件等，目前關(guān)于代謝途徑改造以高產(chǎn)克拉酸相關(guān)研究較少。克拉酸應(yīng)用前景廣闊，因此通過系統(tǒng)代謝工程改造構(gòu)建高效生產(chǎn)克拉酸的大腸桿菌菌株對(duì)于后續(xù)克拉酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)尤為必要，特別是能提供一種無需在發(fā)酵制備克拉酸的過程中額外添加堿性物質(zhì)以維持pH的方法，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)有重大的意義。

發(fā)明內(nèi)容