[發明專利]氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D

在審

• 申請號: 202210723017.4
• 申請日: 2022-06-24
• 公開（公告）號: CN114990093A
• 公開（公告）日: 2022-09-02
• 發明（設計）人: 李占軍;趙飛宇;張濤;隋婷婷;張曦勻;胡銘洋
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/66;C12N15/70;C12N5/10;C12Q1/6851
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 白冬冬

一種蛋白序列MINI RFX?CAS13D，屬于生物工程技術領域。本發明的目的是提供一種編輯活性高、CAS13D蛋白小的氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX?CAS13D。本發明氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX?CAS13D具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，MINI RFX?CAS13D蛋白是RFX?CAS13D的人工缺失版本。本發明能精確靶向RNA序列，并產生切割，使RNA斷裂損傷，在基因編輯領域中具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，特別是涉及一種基因編輯技術。

背景技術

CRISPR/Cas13是細菌和古細菌為抵御外源病毒或質粒入侵而進化的一種獲得性免

疫系統。在CRISPR/Cas13系統中，crRNA與Cas13蛋白形成復合體后，Cas13蛋白被激活發生結構改變，crRNA會與靶RNA序列形成互補結構，Cas13蛋白行使切割RNA的功能，使RNA發生斷裂損傷。

除了基礎科研外，CRISPR/Cas13還具有廣泛的臨床應用前景。利用CRISPR/Cas13系統做基因治療時，需要把Cas13和crRNA導入到體內。目前做基因治療最有效的遞送載體是AAV病毒。但是AAV病毒包裝的DNA一般不超過4.5kb。RFX Cas13D因為活性高得到廣泛應用。但是RFX Cas13D蛋白有987個氨基酸，加上crRNA和啟動子，雖然能夠包裝到AAV病毒中，但是對于連接其它RNA修飾的蛋白卻不夠，限制了其在臨床中的應用。為了解決這個問題，幾種小的Cas13被發明出來，包括CAS13X；CAS13BT1；CAS13BT2；CAS13BT3，但是這些Cas13編輯效率低，難以廣泛應用。尋找Cas13蛋白小，編輯活性高。

發明內容

本發明的目的是提供一種編輯活性高、CAS13D蛋白小的氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D。

本發明氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，MINI RFX-CAS13D蛋白是RFX-CAS13D的人工缺失版本。

本發明 MINI RFX-CAS13D蛋白和crRNA復合體構成CRISPR/Cas13系統，能精確定位靶向RNA序列，并產生切割，使RNA斷裂損傷。

本發明缺失片段的選擇：

步驟一：根據CAS13D家族蛋白的結構解析文章對蛋白各結構域、功能域以及重要motif進行分析；

步驟二：根據分析結果進行適當判斷并進行合理推測；

步驟三：合成推測的蛋白序列，并用實驗驗證，得到結果，驗證推測；

步驟四：根據步驟一到三的結果進行缺失片段的調整，篩選出最優結果，即敲除效率與RFX CAS13D相當、氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D。

本發明MINI RFX-CAS13D氨基酸序列合成步驟如下：

步驟一：合成MINI RFX-CAS13D的氨基酸序列對應的核苷酸序列；

步驟二：將合成序列構建到骨架載體pAB1678 CMV-HIVNES-GS-Cas13bt1

上，即將合成MINI RFX-CAS13D的核苷酸序列將骨架載體上的CAS13bt1的核苷酸序列進行替換，得到CMV-MINI RFX-CAS13D；

步驟三：轉化、挑菌、測序，確定目標序列已正確構建到骨架載體上，CMV-MINIRFX-CAS13D的測序結果與我們的預期構建序列一致，得到目標質粒；

步驟四：吸取1μl CMV-MINI RFX-CAS13D質粒轉化進DH5α感受態大腸桿菌，涂板，37℃ 12h, 挑取單克隆至搖菌管，37℃ 12h 200rpm，將搖菌管中的液體倒入200ml 液體LB培養基 ，37℃ 12h，用大提質粒試劑盒提取CMV-MINI RFX-CAS13D質粒，完成質粒的擴增。