[發(fā)明專利]一種分離提取胃癌組織來源細胞外囊泡多種亞群的方法

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• 申請日: 2022-06-22
• 公開（公告）號: CN114990052A
• 公開（公告）日: 2022-09-02
• 發(fā)明（設計）人: 張常華;霍明宇;張華奇;吳菁;鄧存燦
• 申請（專利權）人: 中山大學附屬第七醫(yī)院（深圳）
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/09
• 代理公司: 深圳市創(chuàng)富知識產(chǎn)權代理有限公司 44367
• 代理人: 侯騰騰

本發(fā)明公開了一種分離提取胃癌組織來源細胞外囊泡多種亞群的方法，屬于生物醫(yī)學技術領域。所述方法為先將腫瘤組織浸入消化液中進行酶解消化，獲得組織消化上清液，同時配制不同的消化液來優(yōu)化酶解消化工藝，然后對組織消化上清液分別進行多次差速離心，從而獲得組織來源細胞外囊泡及其亞群。這種分離提取方法成本低、試劑易獲得、配制簡單、品牌可選擇范圍廣，而且優(yōu)選用膠原酶II和DNaseI配制的消化液比用其他消化液的提取效率高，能更加真實地反映腫瘤來源細胞外囊泡的生物學功能和作用模式，還有助于腫瘤組織來源細胞外囊泡提取技術的發(fā)展。

技術領域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學技術領域，特別涉及一種分離提取胃癌組織來源細胞外囊泡多種亞群的方法。

背景技術

細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的直徑多為30nm-150nm，擁有雙層脂質膜結構，細胞外囊泡由體內多種細胞分泌，其內包含了多種來源于母細胞的蛋白質、RNA等多種生物活性物質，能參與細胞通訊、細胞遷移、血管新生和腫瘤細胞生長等過程，廣泛地存在于各種體液和組織間隙中，并穩(wěn)定攜帶了一些重要的信號分子。細胞外囊泡進入細胞外基質后能夠定向移動，并特異性地與靶細胞結合，通過與靶細胞表面受體結合而激活胞內信號級聯(lián)反應，也可以通過細胞外囊泡的囊泡內化、融合作用將內部的生物活性物質直接釋放入靶細胞內，導致靶細胞的生物學功能發(fā)生改變，從而達到相應的調控作用。細胞外囊泡的生物作用廣泛，不同細胞來源的EVs所運載的特異性生物活性物質能夠在不同的環(huán)境中起到重要的調控作用。而且細胞外囊泡由于穩(wěn)定的雙層脂質膜結構，能夠抵御大部分的降解、破壞作用，擁有良好的運載潛力。在目前的研究中，大多數(shù)細胞外囊泡都是通過細胞系的分泌得來，而探究細胞外囊泡對機體的病理生理學功能，在腫瘤疫苗、生物標志物、化療藥物載體、靶向生物治療等領域具有重要的指導價值。但是，人體組織中的細胞構成十分復雜，多種細胞通過一定的分布構成人體組織即可發(fā)揮正常的生理功能，因此，通過體外培養(yǎng)的細胞系提取的細胞外囊泡并不能真實反映細胞外囊泡在人體內的生物學功能。

近年來，由于組織來源的細胞外囊泡(tissue-derived extracellularvesicles)能直接從組織樣本中分離提取得到，且通過對提取到的細胞外囊泡進行亞群分類、蛋白組學及轉錄組學檢測，能夠發(fā)現(xiàn)組織細胞外囊泡所包含的更多病理生理學信息，可以更加真實地反映腫瘤來源細胞外囊泡的生物學功能和作用模式，這些發(fā)現(xiàn)使得組織來源細胞外囊泡的概念逐漸被推廣。但是作為細胞外囊泡研究的新興領域，組織來源細胞外囊泡的提取技術還處于摸索階段，而且多種惡性腫瘤的組織來源細胞外囊泡尚未具備準確高效的提取技術，對于組織來源外泌體的具體構成也尚未清楚。目前，組織來源細胞外囊泡的提取方法主要有酶消化法和浸出法兩種，但由于使用的分子排阻色譜法(Size exclusionchromatography，SEC)、超濾管、消化酶成本過高，試劑應用復雜，操作步驟繁瑣等問題，所以無法進行廣泛的應用。在現(xiàn)有的研究中，已發(fā)現(xiàn)腎癌、黑色素瘤組織來源的細胞外囊泡并不是統(tǒng)一的整體，存在多種亞群分群的情況，而胃癌作為發(fā)病率很高的惡性腫瘤之一，還沒有明確胃癌組織來源細胞外囊泡的亞群分群情況，也沒有相關的提取技術標準。因此，如果能分離提取出胃癌組織來源細胞外囊泡的多種亞群，則可以真實地反映胃癌組織來源細胞外囊泡的生物學功能和作用模式。

發(fā)明內容

本發(fā)明通過配制一種消化液優(yōu)化酶解消化工藝，再結合差速離心法分離提取了胃癌組織來源的細胞外囊泡多種亞群，以解決目前胃癌組織來源細胞外囊泡亞群的分離提取方法較少以及成本過高的問題。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下：

一種分離提取胃癌組織來源細胞外囊泡多種亞群的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

步驟1：將胃癌組織浸入配制的消化液中進行酶解消化過濾后得到組織消化上清液，所述消化液為膠原酶II和脫氧核糖核酸酶I的混合液，或膠原酶IV和脫氧核糖核酸酶I的混合液，所述消化液也可以是乙二胺四乙酸和二硫蘇糖醇的混合液與膠原酶IV的組合溶液；