[發明專利]一種中性植酸酶突變體

在審

• 申請號: 202210710439.8
• 申請日: 2022-06-22
• 公開（公告）號: CN114958804A
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 汪小杰;張藝達
• 申請（專利權）人: 上海佶凱星生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;A23K20/189;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及基因工程與蛋白質改造技術領域，具體涉及一種中性植酸酶突變體。本發明以野生型中性植酸酶PhyC為基礎，提供了比活力得到顯著提高的突變體，突變體包含L255Q，V296T，V372T中至少一個突變位點，與野生型中性植酸酶相比，本發明提供的突變體的比活力普遍提高了26.14?109.33%。其中，L255Q/V296T/V372T三點突變的中性植酸酶突變體的比活力最高，達45.32 U/mg，比野生型中性植酸酶PhyC提高了109.33%。本發明的中性植酸酶突變體有利于降低中性植酸酶的生產成本，促進其在飼料領域的廣泛應用。

技術領域

本發明屬于蛋白質改造技術領域，具體涉及一種比活得到顯著提高的中性植酸酶突變體。

背景技術

植酸是豆類、谷類和油料作物等種子中磷的主要儲存形式，植酸酶能夠水解植酸生成無機磷和磷酸肌醇衍生物，在動物飼料中添加植酸酶可以有效地提高植酸中磷的利用效率、降低動物排泄物的環境磷污染，并能通過去除植酸的抗營養作用來提高飼料的營養價值，對具有高比活和良好熱穩定性植酸酶的需求，促進了酶資源的開發利用以及植酸酶基因工程和蛋白質工程研究，也為更好應用于實踐生產奠定基礎。中性植酸酶也稱螺旋槳植酸酶，主要來源于芽孢桿菌，是耐熱性較好，最適反應呈中性（pH 7.0-7.5）,能夠分解植酸釋放磷元素，并且與金屬離子有關的一類酶，尤其是對于植酸酶酶活性及穩定性起到至關重要的作用。這一類植酸酶可在鯉科魚類及單胃動物等值呈中性的腸道中起作用，而酸性植酸酶在中性條件下活性基本喪失，因此，中性植酸酶彌補了酸性植酸酶性質上的不足，可提高植酸酶在動物胃腸道的效用，拓寬植酸酶的應用范圍。

中性植酸酶主要指β-螺旋槳(BPP)植酸酶，即β-propeller中性植酸酶，主要來源于芽孢桿菌屬。第一個報道的植酸酶是來源于Bacillus的植酸酶，該酶分子量為43 kDa，最適pH是7.0，最適溫度55℃,，酶活性依賴于Ca²⁺的存在。Oh等推測植物來源的植酸酶可能具有與BPP相似的催化機制，Lilium longiflorum花粉和許多豆類植物來源的植酸酶活性與BPP植酸酶一樣，在Ca²⁺存在條件下活性顯著提高。此外，Zhang等和Huang等分別克隆了天牛腸道菌株Janthion-bacterium sp.TN 115的中性植酸酶基因和菌株中性植酸酶基因，并將其在大腸桿菌BL21 (DE3)中進行誘導表達。

芽孢桿菌來源的β-propeller中性植酸酶都具有相似的酶學性質，其最適范圍都在6.0-8.0之間，具有相近的分子量和酶促反應最適pH（7.0左右），具有較高的熱穩定性，其催化活性、熱穩定性及pH穩定性均依賴于Ca²⁺。Ca²⁺具有穩定植酸酶空間結構的作用。中性植酸酶對植酸鹽具存高度的特異性，其最適反應底物是植酸及其鹽類復合物，將植酸酶加入到其它含有磷酸基團底物中，檢測不到酶活性，且具有較小Km的值，表明對底物的親和性較好。芽孢桿菌中性植酸酶對胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶的抵抗力都很強，對胃蛋白酶卻相當敏感，添加少量的胃蛋白酶在短時間內便可將植酸酶降解。

中性植酸酶在食品方面的應用主要是作為食品添加劑添加到食品中，降解植酸，消除其抗營養作用，而提高礦質元素的吸收率，改善人體對礦物質的吸收和提高食品加工技術。由于低磷酸肌醇在生物體內重要的生理作用，所以在醫藥工業中生產的肌醇及其磷酸鹽也備受人們關注。中性植酸酶在農業上的用途主要作為飼料添加劑應用于水產養殖，飼料中添加外源植酸酶可以提高植酸磷的利用率，降低磷的排泄，在虹鱒、斑點叉尾鮰和條紋鱸等幾種魚的飼料中添加植酸酶尤其具有明顯的效果，此外還可以提高礦物元素的生物利用率，提高魚類對蛋白質及脂肪的利用，降低植酸鹽的抗營養作用，同時提供營養物質，增加經濟效益，所以中性植酸酶制劑的研發在食品、醫藥及水產養殖領域具有廣闊的應用前景。

天然菌株所產的中性植酸酶產量低，不能滿足工業化生產的需要，提高現有的中性植酸酶的酶活力和酶的性能對于其生產成本的控制效果的發揮有著至關重要的作用。因此篩選高活性的中性植酸酶是近年來的研究熱點和難點。