[發明專利]水溶液穩定性堿性蛋白酶2709突變體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202210708362.0
• 申請日: 2022-06-21
• 公開（公告）號: CN114908074A
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發明（設計）人: 張劍;石赟;楊媛
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12N9/54
• 分類號: C12N9/54;C12N15/75;C12N1/21;G16B5/00;C11D3/386;C12R1/125
• 代理公司: 太原申立德知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 14115
• 代理人: 郭海燕

本發明屬于蛋白質工程改造技術領域，公開了一種水溶液穩定性堿性蛋白酶2709突變體及其制備方法和應用。本發明首先基于親疏水性能理論設計，用分子動力學計算方法測試改變堿性蛋白酶2709氨基酸分子的親疏水性能對其在水溶液中穩定性的影響。以減少蛋白酶發生脫酰胺反應的幾率為基準，選擇2709堿性蛋白酶分子中對水溶液穩定性貢獻最大的氨基酸殘基位點進行蛋白質工程改造，獲得了具有較高水溶液穩定性能的堿性蛋白酶2709突變體，而且在不加任何保護劑和穩定劑的前提下，添加本發明堿性蛋白酶2709突變體的標準液體洗滌劑的剩余酶活力更高，穩定性更好，可以用于洗滌劑或清潔劑中。

技術領域

本發明屬于蛋白質工程改造技術領域，具體涉及一種水溶液穩定性堿性蛋白酶2709突變體及其制備方法和應用。

背景技術

堿性蛋白酶2709是由細菌原生質體誘變選育出的地衣芽孢桿菌2709經深層發酵、提取及精制而成的一種蛋白水解酶，最適溫度為40℃，最適pH值為10.5。它是一種絲氨酸型的內切蛋白酶，在一定溫度、pH值下能將大分子的蛋白質水解成多肽及氨基酸等產物，具有較強的分解蛋白質的能力。廣泛應用于皮革加工、紡織和洗滌劑中。在皮革加工中，堿性蛋白酶2709可分解毛、表皮同真皮層連接處的蛋白質，使毛同皮的聯結松開而脫毛；在紡織加工中，主要用來解決羊毛仿羊絨物質的生硬、粗糙等問題，并能改善和提高絲綢與棉、麻、毛等纖維混紡產品的手感和風格；在洗滌方面，能與洗滌劑配方成分有更好的配伍性，大幅度提高洗滌去污能力，對血漬、汗漬、奶漬、油漬等蛋白類污垢，有很好的洗滌效果。

但是，堿性蛋白酶常常會因保存不當而造成酶活力下降影響其使用效果。堿性蛋白酶產品開啟后要盡量使用完畢，因為空氣的進入以及周圍環境溫度的變化，容易滋生細菌，其次接觸堿性蛋白酶的器皿要保持干凈無污染。固體形態的酶制劑相較其液體形態要穩定，如葡萄糖氧化酶干粉0℃下可保存2年，-15℃下可保存8年。液態酶制劑因含水量大，導致其水溶液穩定性差，保質期短，酶活相比固態更容易損失。因此，提高蛋白酶在水溶液中的穩定性非常重要。

發明內容

針對上述問題本發明提供了一種水溶液穩定性堿性蛋白酶2709突變體及其制備方法和應用。

為了達到上述目的，本發明采用了下列技術方案：

本發明提供了一種水溶液穩定性堿性蛋白酶2709突變體，所述堿性蛋白酶2709突變體依據氨基酸側鏈的疏水性參數△G′值，即乙醇和水之間自由能變化比原地衣芽孢桿菌蛋白酶2709親本序列氨基酸增加1kJ/mol及以上，所述堿性蛋白酶2709突變體至少包含有以下位置的疏水性氨基酸修飾中的一個：25、43、57、61、76、96、116、122、127、140、154、160、162、182、184、211、217、239、247、268，其中所述位置對應于氨基酸序列SEQ ID NO：1的位置。

進一步，所述堿性蛋白酶2709突變體包含以下氨基酸修飾置換中的一種或三種或六種：第61位氨基酸殘基突變為絲氨酸、第96位氨基酸殘基突變為丙氨酸、第116位氨基酸殘基突變為丙氨酸、第122位氨基酸殘基突變為酪氨酸、第140位氨基酸殘基突變為色氨酸、第160位氨基酸殘基突變為絲氨酸、第162位氨基酸殘基突變為絲氨酸、第182位氨基酸殘基突變為絲氨酸、第211位氨基酸殘基突變為絲氨酸、第217位氨基酸殘基突變為丙氨酸、第217位氨基酸殘基突變為絲氨酸、第247位氨基酸殘基突變為丙氨酸，其中所述位置對應于氨基酸序列SEQ ID NO：1的位置。

進一步，所述堿性蛋白酶2709突變體為將第116位氨基酸殘基突變為丙氨酸、第140位氨基酸殘基突變為丙氨酸、第247位氨基酸殘基突變為丙氨酸，其中所述位置對應于氨基酸序列SEQ ID NO：1的位置。

進一步，所述堿性蛋白酶2709突變體為將第96位氨基酸殘基突變為丙氨酸、第122位氨基酸殘基突變為丙氨酸、第217位氨基酸殘基突變為丙氨酸，其中所述位置對應于氨基酸序列SEQ ID NO：1的位置。