[發(fā)明專利]用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌的核酸分子、試劑盒和檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210707485.2
• 申請(qǐng)日: 2022-06-21
• 公開（公告）號(hào): CN115074454A
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邱小彤;李振軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/22
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 商秀玲

1.用于肺炎克雷伯菌檢測(cè)的LAMP引物組，其特征在于，所述引物組包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1-5所示的引物。

2.一組用于肺炎克雷伯菌檢測(cè)的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含權(quán)利要求1所述的用于肺炎克雷伯菌檢測(cè)的LAMP引物組以及gRNA和ssDNA探針；

其中，所述gRNA靶向肺炎克雷伯菌rcsA基因的DNA片段，所述DNA片段為采用所述LAMP引物組擴(kuò)增得到；

所述ssDNA探針為符合Cas12蛋白反式切割原則的單鏈DNA。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于肺炎克雷伯菌檢測(cè)的核酸分子，其特征在于，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于肺炎克雷伯菌檢測(cè)的核酸分子，其特征在于，所述ssDNA探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

和/或，ssDNA探針的5’端和3’端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，或者，ssDNA探針5’端和3’端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和生物素。

5.試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求2～4任一項(xiàng)所述的用于肺炎克雷伯菌檢測(cè)的核酸分子和CRISPR-Cas蛋白；

所述CRISPR-Cas蛋白具有切割ssDNA或ssRNA的活性。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述CRISPR-Cas蛋白為AapCas12b。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含選自LAMP反應(yīng)緩沖液、Bst 2.0DNA聚合酶、CRISPR反應(yīng)緩沖液和水中的一種或多種。

8.一種基于CRISPR-top技術(shù)檢測(cè)肺炎克雷伯菌的非診斷目的的方法，其特征在于，所述方法利用權(quán)利要求5～7任一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，包括：將CRISPR-Cas蛋白、gRNA與CRISPR反應(yīng)緩沖液混合，經(jīng)反應(yīng)得到CRISPR-Cas蛋白/gRNA復(fù)合物；

將用于肺炎克雷伯菌檢測(cè)的LAMP引物組、Bst 2.0DNA聚合酶、LAMP反應(yīng)緩沖液、CRISPR-Cas蛋白/gRNA復(fù)合物、ssDNA探針與待測(cè)樣品的DNA混合后于恒溫條件下進(jìn)行CRISPR-top反應(yīng)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述CRISPR-top反應(yīng)的體系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和4所示的引物的濃度為0.4～1.2μM,核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物的濃度為0.2～0.6μM,核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示的引物的濃度為0.1～0.3μM；

和/或，所述CRISPR-top反應(yīng)的體系中，ssDNA探針的濃度為1.2～6μM。

10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述恒溫條件為53℃～58℃。