[發明專利]一種使用重組枯草芽孢桿菌分泌天然胞內β-半乳糖苷酶的方法

在審

• 申請號: 202210702442.5
• 申請日: 2022-06-21
• 公開（公告）號: CN114875013A
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 段緒果;欒舒越;黃婷婷
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12N9/38
• 分類號: C12N9/38;C12N15/56;C12N15/75;C12N1/21;C12R1/125
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 曹坤

本發明公開了一種使用重組枯草芽孢桿菌分泌天然胞內β?半乳糖苷酶的方法。屬于基因工程以及微生物工程技術領域，本發明通過人工合成lacZBa基因、設計引物、PCR獲得B.aryabhattai Gel?09來源β?半乳糖苷酶目的基因，構建重組質粒pCut?lacZBa，并轉化至枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600，得到重組枯草芽孢桿菌。以此枯草芽孢桿菌為菌種，發酵生產β?半乳糖苷酶lacZBa。本發明以食品安全的枯草芽孢桿菌為表達宿主重組表達β?半乳糖苷酶，產酶水平高，便于分離純化，且發酵原料來源廣泛，生產成本較低。

技術領域

本發明屬于酶工程和微生物工程技術領域，涉及一種使用重組枯草芽孢桿菌分泌天然胞內β-半乳糖苷酶的方法，特別是涉及一種高效分泌天然胞內β-半乳糖苷酶的重組枯草芽孢桿菌。

背景技術

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)表達系統是一種具有重要價值的原核表達系統。1958年，枯草芽孢桿菌吸收外源基因這一特性被發現，該系統逐漸被廣泛研究，目前枯草芽孢桿菌表達系統已被廣泛用于淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶等多種工業酶的生產中。

枯草芽孢桿菌表達系統具有眾多的優點：培養條件相對簡單，在成分較為普通的培養基中仍可生長到高密度；發酵工藝成熟，可以進行高密度發酵；該系統沒有明顯的密碼子偏好且遺傳性較強，噬菌體和質粒均能作為載體；另外，枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，結構簡單，不含有內毒素，無致病性，也被稱作食品安全菌；枯草芽孢桿菌表達系統具有強大的蛋白分泌系統，枯草芽孢桿菌中至少有4種依賴于信號肽的蛋白質分泌表達系統，具體為經典分泌途徑(Sec依賴的蛋白質分泌途徑)、雙精氨酸分泌途徑(Tat依賴的蛋白質分泌途徑)、ABC分泌途徑(ATP結合性盒式轉運蛋白)以及假菌絲蛋白輸出途徑。因此，相較于大腸桿菌表達系統，外源蛋白在枯草芽孢桿菌中更易實現高效的胞外表達，除此之外，通過對枯草芽孢桿菌啟動子以及表達強度的調控，更易避免包涵體的產生。

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)，全稱為β-D-半乳糖苷酶，又稱為乳糖酶，能夠水解β-1,4-半乳糖苷鍵，將底物乳糖分解為葡萄糖和半乳糖，有些也兼有轉糖苷作用，是一種具有重要應用價值的工業酶。全世界有70％以上的成年人口存在乳糖不耐受問題，其中90％以上是東亞人。β-半乳糖苷酶能催化乳糖分子中β-1,4-糖苷鍵的水解，可用于無乳糖、低乳糖牛奶等乳制品的生產，具有重要應用價值。同時，乳糖的水解可以形成更多葡萄糖和半乳糖，更利于牛奶的發酵和提高酸奶中乳酸的含量。此外，乳糖水解為溶解度更高的單糖，可避免在煉乳和冰淇淋等產品中形成乳糖結晶(砂礫現象)，有利于提高產品的風味和質量。由于乳品工業對β-半乳糖苷酶的巨大需求，近年來β-半乳糖苷酶的生產受到了廣泛關注。重組表達是獲得高產β-半乳糖苷酶的主要方法，但表達水平卻受包括目標蛋白的性質、密碼子使用偏好、表達系統、發酵條件等多種因素影響。以往的研究表明，大多數細菌來源的β-半乳糖苷酶是胞內酶。胞內酶的工業化生產有許多缺點：可溶性表達較低；容易形成包涵體；下游操作過程復雜且成本高昂。因此，如何實現天然胞內β-半乳糖苷酶的胞外分泌，對β-半乳糖苷酶的高效制備具有重要意義。

發明內容

發明目的：本發明的目的是提供了一種具有高分泌能力的重組枯草芽孢桿菌，能夠將天然胞內β-半乳糖苷酶高效地胞外分泌生產。

技術方案：本發明所述的一種使用重組枯草芽孢桿菌分泌天然胞內β-半乳糖苷酶的方法，以重組枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600為宿主，以pCut為表達載體，表達氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的B.aryabhattai Gel-09來源的天然胞內β-半乳糖苷酶。

進一步的，構建權利要求1所述的基因工程菌(重組枯草芽孢桿菌)的方法，將SEQID NO.2所示的編碼天然胞內β-半乳糖苷酶lacZBa的基因與表達載體pCut連接，轉入宿主重組枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600；具體的：

(1)、擴增SEQ ID NO.2所示的β-半乳糖苷酶基因；