[發明專利]一種重組EK酶工程菌的高密度發酵方法

有效

• 申請號: 202210698517.7
• 申請日: 2022-06-20
• 公開（公告）號: CN114774398B
• 公開（公告）日: 2022-10-04
• 發明（設計）人: 曹海燕;林兆生;連婕妮;王惠;朱志偉;辛瑞
• 申請（專利權）人: 北京惠之衡生物科技有限公司;吉林惠升生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N1/21;C12N15/62;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 北京開陽星知識產權代理有限公司 11710
• 代理人: 董亞男

1.一種重組EK酶工程菌的高密度發酵方法，其特征在于，所述高密度發酵方法至少包括以下步驟：

S1、構建重組EK酶工程菌，包括：

合成表達包含EK酶的重組融合蛋白的表達框序列，所述表達框序列如SEQ ID No.4所示，將所述表達框序列插入到表達載體上，構建得到重組表達載體，并將所述重組表達載體導入到大腸桿菌中，得到所述重組EK酶工程菌，凍存備用；

S2、菌種活化，得活化種子培養液；

S3、發酵培養：將所述活化種子培養液接種至發酵培養基，發酵過程中，流加補料培養基；

所述補料培養基的組成為：質量體積百分比含量分別為50% ~ 65%的葡萄糖水溶液和15% ~ 25%的酵母浸粉水溶液，按照體積比1：3 ~ 4混合；

S4、誘導表達：當OD 600值為145 ~ 150時，添加IPTG誘導EK酶的表達，至OD600值出現平臺期發酵結束。

2.根據權利要求1所述的高密度發酵方法，其特征在于，在步驟S1中，所述表達框序列插入到pET-30a（+）的NdeI和XhoI酶切位點之間。

3.根據權利要求1所述的高密度發酵方法，其特征在于，在S2中，所述菌種活化包括以下步驟：

一級活化：取凍存的所述重組EK酶工程菌，按照1：800 ~ 1200的體積比，接種至活化培養基，35 ~ 38℃，200 ~ 240 rpm，培養12 ~ 16小時，至菌種OD600值為4.0 ~ 8.0，得一級活化種子液；

二級活化：將所述一級活化種子液按照1：4 ~ 6的體積比接種至活化培養基，35 ~ 38℃，200 ~ 240 rpm，培養2 ~ 5小時，至菌種OD600值為3.0 ~ 4.0，得二級活化種子培養液。

4.根據權利要求1所述的高密度發酵方法，其特征在于，在S3中，將所述S2中活化種子培養液按照1：5 ~ 15的體積比接種至發酵培養基；發酵條件為：溫度36 ~ 38℃，空氣的通氣量450 ~ 550 mL/min，氧氣的通氣量0 ~ 300 mL/min，轉速300 ~ 1400 rpm；并通過對空氣通氣量、氧氣通氣量和轉速調整，將溶氧控制在15% ~ 30%；發酵開始后，pH伴隨溶氧同時開始上升時開始流加補料培養基，所述流加補料培養基的時間為10 ~ 12小時。

5.根據權利要求4所述的高密度發酵方法，其特征在于，在S3中，通過流加補料培養基控制發酵液的OD600值每小時增加7 ~ 12。

6.根據權利要求1所述的高密度發酵方法，其特征在于，所述誘導的溫度為27 ~ 33℃，IPTG終濃度為0.9 ~ 1.1 mmol。

7.根據權利要求3所述的高密度發酵方法，其特征在于，所述活化培養基的組成為：胰蛋白胨16 ~ 22 g/L、酵母浸粉8 ~ 14 g/L、氯化鈉8 ~ 12 g/L，余量為水。

8.根據權利要求1所述的高密度發酵方法，其特征在于，所述發酵培養基的組成為：

酵母浸粉 8 ~ 12 g/L；

一水合檸檬酸 0.8 ~ 1.2 g/L；

硫酸銨 4 ~ 6 g/L；

磷酸二氫鉀 5 ~ 7 g/L；

七水合硫酸亞鐵0.04 ~ 0.05 g/L

無水氯化鈣 0.001 ~ 0.003 g/L

葡萄糖 9.5 ~ 11.5 g/L；

硫酸鎂 11 ~ 13 g/L；

溶液D 900 ~ 1100 μL/L；

消泡劑 50 ~ 150 μL/L；

溶液D的組成為：

七水合硫酸亞鐵 3.3 ~ 3.4 g/L；

七水合硫酸鋅 0.8 ~ 0.9g/L；

一水合硫酸錳 0.5 ~ 0.55 g/L；

四水合鉬酸銨 0.16 ~ 0.2 g/L；

五水合硫酸銅（II） 0.1 ~ 0.15 g/L；

磷酸 45 ~ 50 mL/L；

所述發酵培養基使用氫氧化鈉溶液調節pH至6.7 ~ 7.0。