[發明專利]包含牛腸激酶輕鏈蛋白的融合蛋白及其表達載體和重組工程菌

有效

• 申請號: 202210697584.7
• 申請日: 2022-06-20
• 公開（公告）號: CN114807101B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發明（設計）人: 曹海燕;林兆生;連婕妮;王惠;劉偉華;徐艷玲
• 申請（專利權）人: 北京惠之衡生物科技有限公司;吉林惠升生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京開陽星知識產權代理有限公司 11710
• 代理人: 董亞男

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種包含牛腸激酶輕鏈蛋白的融合蛋白，及其表達載體和重組大腸桿菌工程菌。本發明通過對腸激酶酶切位點多肽、連接體多肽和伴侶蛋白的選擇，提高了融合蛋白的表達量和表達穩定性。本發明的牛腸激酶輕鏈蛋白重組工程菌能夠顯著提高牛腸激酶輕鏈蛋白的表達量和活性收率。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種包含牛腸激酶輕鏈蛋白的融合蛋白及其表達載體和重組大腸桿菌工程菌。

背景技術

絲氨酸蛋白酶腸激酶（enterokinase）（簡稱腸激酶或EK酶），也被稱為腸肽酶（enteropeptidase），是異源二聚體絲氨酸蛋白酶，一種催化胰蛋白酶原轉變為活性胰蛋白酶的哺乳動物酶。腸激酶優先選擇底物序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（DDDDK），并選擇性地在賴氨酸之后切割。由于腸激酶的輕鏈結構在人、牛和豬中保守，其識底物別序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys在脊椎動物中也有很強的保守性，且幾乎所有被定序的胰蛋白酶原都具有作用于4個天冬酰胺相連識別序列的特征，而此序列在其他的天然蛋白質上又非常罕見。腸激酶由1條結構亞基（重鏈）和1條催化亞基（輕鏈）構成，兩者通過1個分子間二硫鍵結合，結構亞基負責將催化亞基固定在小腸刷狀緣膜上并引導它向腸腔移動，催化亞基可以特異性識別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下，將胰蛋白酶原活化為胰蛋白酶，從而啟動各種酶原活化的級聯。

在大腸桿菌（E.coli）中，許多哺乳動物蛋白被表達為融合蛋白，其必須被切割以釋放成熟的活性蛋白。為了實現該目的，就需要有使用工具酶，優選直接在連接處切割而在產物上不留下額外氨基酸的工具酶。由于腸激酶的底物酶切位點序列具有上述高度的特異性，使得其成為基因工程融合蛋白表達后修飾過程中一個極其有用的工具酶而被廣泛應用。

目前，重組基因工程菌表達是制備重組工具酶的主要方法，表達系統包括原核基因表達系統、真核基因表達系統和動物細胞表達系統。而在工具酶制備中，前兩者是最為常用的表達系統。對于原核基因表達系統，使用最多的即為大腸桿菌Escherichiacoli來作為宿主菌，這也是目前應用最廣泛的蛋白表達系統。原因是大腸桿菌表達系統遺傳背景和生理特性研究清楚，已開發有多種商業化工程菌可以使用；且大腸桿菌易于培養和控制、轉化操作簡單，并具有表達水平高、成本低、周期短等特點。對于應用原核系統表達外源基因時，大多研究利用融合蛋白表達方式，將各種不同的引導肽序列融合到目的基因上，形成重組融合蛋白。在大腸桿菌中表達時，引導肽可以將目的蛋白分泌到細胞周質甚至細胞外，最后，通過蛋白酶等將引導肽切除去。

但由于腸激酶自身氨基酸序列和結構特點，對于目前廣泛應用的大腸桿菌表達系統獲得的其包涵體存在著蛋白表達量低、包涵體產物復性困難等的問題。因此，仍需要能夠更優的適應大腸桿菌表達系統，具備更高的分泌表達和活性收率的重組腸激酶。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種包含牛腸激酶輕鏈蛋白的融合蛋白，及其表達載體和重組大腸桿菌工程菌。

本發明通過對酶切位點、連接體多肽和伴侶蛋白等的選擇，構建得到包含牛腸激酶輕鏈蛋白的融合蛋白，并將其用于構建重組工程菌以高效表達EK酶或突變的EK酶。

本發明第一方面提出包含牛腸激酶輕鏈蛋白的融合蛋白，融合蛋白包括牛腸激酶輕鏈、腸激酶酶切位點多肽和伴侶蛋白。其中，牛腸激酶輕鏈可以為野生型，也可為突變型。腸激酶酶切位點多肽的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。腸激酶酶切位點多肽和伴侶蛋白之間可以直接相連，并優選通過連接體多肽相連?？捎玫倪B接體多肽實例如SEQ ID No:3 ~SEQ ID No:6所示，伴侶蛋白可選自如SEQ ID No:7~ SEQ ID No:11所示氨基酸序列的伴侶蛋白，伴侶蛋白可幫助牛腸激酶輕鏈蛋白高效表達。

具體的，連接體多肽氨基酸序列如表1所示：

表1