[發(fā)明專利]牛腸激酶輕鏈蛋白突變體及重組融合蛋白

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210697582.8
• 申請日: 2022-06-20
• 公開（公告）號: CN114774397B
• 公開（公告）日: 2022-10-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹海燕;林兆生;徐艷玲;王惠;董欣;尤冬超
• 申請（專利權(quán)）人: 北京惠之衡生物科技有限公司;吉林惠升生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C07K19/00
• 代理公司: 北京開陽星知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11710
• 代理人: 董亞男

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體講，涉及牛腸激酶輕鏈蛋白突變體及重組融合蛋白。本發(fā)明的牛腸激酶輕鏈蛋白突變體為在野生型牛腸激酶輕鏈基礎(chǔ)上，包含一項或多項選自K101P突變、C112T突變、L134K突變、I135K突變、A177K突變或A177E的突變。本發(fā)明的重組融合蛋白包括牛腸激酶輕鏈蛋白突變體，該突變體具備顯著提高牛腸激酶輕鏈蛋白的收率。而本發(fā)明提出的重組融合蛋白可有效提高目的蛋白表達(dá)量、并幫助其的正確折疊，保證蛋白的活性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體講，涉及牛腸激酶輕鏈蛋白突變體及其重組融合蛋白。

背景技術(shù)

絲氨酸蛋白酶腸激酶（enterokinase）（簡稱腸激酶或EK酶），也被稱為腸肽酶（enteropeptidase），是異源二聚體絲氨酸蛋白酶，一種催化胰蛋白酶原轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚砸鹊鞍酌傅牟溉閯游锩浮Ｄc激酶優(yōu)先選擇底物序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（DDDDK），并選擇性地在賴氨酸之后切割。由于腸激酶的輕鏈結(jié)構(gòu)在人、牛和豬中保守, 其識底物別序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys在脊椎動物中也有很強的保守性, 且?guī)缀跛斜欢ㄐ虻囊鹊鞍酌冈季哂凶饔糜?個天冬酰胺相連識別序列的特征, 而此序列在其他的天然蛋白質(zhì)上又非常罕見。腸激酶由1條結(jié)構(gòu)亞基（重鏈）和1條催化亞基（輕鏈）構(gòu)成，兩者通過1個分子間二硫鍵結(jié)合，結(jié)構(gòu)亞基負(fù)責(zé)將催化亞基固定在小腸刷狀緣膜上并引導(dǎo)它向腸腔移動，催化亞基可以特異性識別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下，將胰蛋白酶原活化為胰蛋白酶，從而啟動各種酶原活化的級聯(lián)。

在大腸桿菌（E.coli）中，許多哺乳動物蛋白被表達(dá)為融合蛋白，其必須被切割以釋放成熟的活性蛋白。為了實現(xiàn)該目的，就需要有使用加工酶，優(yōu)選直接在連接處切割而在產(chǎn)物上不留下額外氨基酸的加工酶。由于腸激酶的底物酶切位點序列具有上述高度的特異性,使得其成為基因工程融合蛋白表達(dá)后修飾過程中一個極其有用的工具酶而被廣泛應(yīng)用。

目前，重組基因工程菌表達(dá)是制備重組工具酶的主要方法，表達(dá)系統(tǒng)包括原核基因表達(dá)系統(tǒng)、真核基因表達(dá)系統(tǒng)和動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。而在工具酶制備中，前兩者是最為常用的表達(dá)系統(tǒng)。對于原核基因表達(dá)系統(tǒng)，使用最多的即為大腸桿菌Escherichiacoli來作為宿主菌，這也是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。原因是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景和生理特性研究清楚，已開發(fā)有多種商業(yè)化工程菌可以使用；且大腸桿菌易于培養(yǎng)和控制、轉(zhuǎn)化操作簡單，并具有表達(dá)水平高、成本低、周期短等特點。

但由于腸激酶自身氨基酸序列和結(jié)構(gòu)特點，對于目前廣泛應(yīng)用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得的其包涵體存在著蛋白表達(dá)量低、包涵體產(chǎn)物復(fù)性困難等的問題。因此，仍需要能夠更優(yōu)的適應(yīng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，具備更高的分泌表達(dá)和活性收率的重組腸激酶。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過大量的研究，提供了多種牛腸激酶輕鏈蛋白突變體及其重組融合蛋白，可顯著提高在重組大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及復(fù)性效率。

本發(fā)明的第一方面提出了一種牛腸激酶輕鏈蛋白突變體，為在野生型牛腸激酶輕鏈基礎(chǔ)上，在101、112、134、135、177位中的至少一個氨基酸發(fā)生突變，具體的突變包括：K101P、C112T、L134K、I135K、A177K或A177E。具體的，本發(fā)明實施的牛腸激酶輕鏈蛋白突變體包含一項或多項選自K101P、C112T、L134K、I135K、A177K或A177E的突變。野生型牛腸激酶輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，上述突變體可改善蛋白的體外復(fù)性效率，提高蛋白本身的溶解性，保持蛋白酶的特異性和活性，進(jìn)而能夠提高收率，實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價值的有效提升。其中，突變所表示的含義如表1所示：

表1