[發明專利]一種制備沙門菌外膜囊泡的方法及其應用

在審

• 申請號: 202210691214.2
• 申請日: 2022-06-17
• 公開（公告）號: CN114921398A
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 郭志成;許騫文;李藝;陳靖萱
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12N15/31;A61K39/39;C12R1/42
• 代理公司: 南昌金軒知識產權代理有限公司 36129
• 代理人: 萬敏

本發明提供一種制備沙門菌外膜囊泡的方法及其應用，屬于生物技術領域。該方法包括構建和培養突變株的沙門菌。本發明還提供所述方法制備的沙門菌外膜囊泡在制備疫苗和疫苗增強劑中的應用。采用本發明方法，沙門菌外膜囊泡的產量較原始菌株在LB培養基中表達量提高了約100倍，顯著降低了生產成本。采用本發明制備的沙門菌外膜囊泡，具有良好的免疫增強功能，可以添加到疫苗中，能夠顯著增強免疫效果。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種制備沙門菌外膜囊泡的方法及其應用。

背景技術

志賀氏菌屬(Shigella spp.)細菌是一類具有高度傳染性以及致病性，并且會引起人類嚴重腹瀉甚至死亡的革蘭氏陰性菌，俗稱痢疾桿菌。痢疾是一種全世界范圍內高發的腸道傳染病，據保守估計，全世界每年的感染人數超過1.6億，死亡人數超過110萬人。

隨著抗生素耐藥性問題越來越嚴重，疫苗防治細菌感染已然成為趨勢。盡管現階段沒有找到一種令人滿意的痢疾疫苗，但研究已經發現了一些具有潛力的候選疫苗靶標，其中志賀氏菌的脂多糖(Lipopolysaccharide) 能夠表現較好的保護力，有研究證明志賀氏菌脂多糖與蛋白的復合體能夠激發小鼠很高的血清抗體滴度，并且能夠表現一定的保護力，臨床實驗表明，福氏2a(Shigella flexneri 2a)的O抗原多糖能夠引起特異的免疫保護，但脂多糖最關鍵的問題在于進入宿主體內，不能有效的到達宿主免疫系統被免疫系統識別，從而有一定概率導致免疫失敗。若能解決該問題，脂多糖有潛力發展成為一種高效的疫苗靶標。脂多糖是大多數革蘭氏陰性菌主要的毒力因子，也是細菌外膜的重要組成成分，由O-抗原(O antigen)、核心多糖(core polysaccharide)以及內脂A(lipid A)組成。通過對沙門菌以及志賀氏菌的脂多糖合成基因簇比較可以發現，其O抗原基因簇在結構上略有不同，但O抗原合成結合于核心多糖位點上所用的酶均為RfaL，在沙門菌外膜上合成志賀氏菌的O抗原，并在合成途徑中結合于沙門菌的核心寡糖上成為可能。有研究利用類似的策略在腸炎沙門菌中表達了大腸桿菌O78的O抗原基因簇，并且通過動物實驗表明通過沙門菌遞呈的O抗原能夠刺激機體產生特異性的免疫反應。

沙門菌外膜囊泡已經被證明是一種高效的遞呈載體，并且有研究證明通過沙門菌外膜囊泡遞呈的PspA蛋白能夠刺激宿主產生較好的免疫反應，并且提供一定的保護力。外膜囊泡由于其脂質雙分子層的特性可以包裹遞呈抗原不被機體過快清除，同時能夠刺激機體引起免疫保護性反應并且避免減毒活疫苗以及滅活疫苗的安全風險，并將蛋白遞呈至宿主深處從而更好的刺激機體產生免疫保護，因此外膜囊泡可以作為一種高效的抗原遞呈載體。理想的外膜囊泡遞呈載體應該具有以下特性：1)外膜囊泡載體本身能夠刺激宿主產生良好的免疫保護反應，但盡可能的避免無意義的免疫反應干擾所遞呈的外源抗原；2)盡可能的簡化外膜囊泡的純化步驟，并盡可能的產生大量的外膜囊泡可以降低生產成本；3)載體本身可以作為佐劑協助所遞呈的抗原被宿主免疫系統所識別，從而發揮更大的功效。

外膜囊泡疫苗由于其有諸多不可比擬的優勢，已經成為多種致病菌疫苗研究的熱點。但現階段大多數致病菌外膜囊泡疫苗更多的只是停留在對其野生型菌株的外膜囊泡進行評估，而對外膜囊泡作為疫苗載體也更多的是停留在無毒性的大腸桿菌工程菌上進行研究。外膜囊泡疫苗在全世界范圍內正處于上升期的研究熱點，而在國內，這方面研究幾乎一片空白。若能夠成功開發出基于外膜囊泡的疫苗遞呈平臺，無論是在基礎研究還是在轉化應用方面均具有巨大的前景。。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的之一是提供一種提高細菌外膜囊泡產量的方法，能夠顯著提高細菌外膜囊泡產量。

本發明的再一目的是提供所述方法制備的細菌外膜囊泡在制備疫苗和免疫增強劑中的應用。

本發明的目的采用如下技術方案實現：

提供一種制備沙門菌外膜囊泡的方法，包括以下步驟：