[發(fā)明專利]可高效表達(dá)飼用低溫角蛋白酶的枯草芽孢桿菌構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210685139.9
• 申請(qǐng)日: 2022-06-14
• 公開（公告）號(hào): CN114958897A
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 游錫火;王玉萬;夏勝;薛棟升;曾徐浩;蔣慧;胡燕;田美華;姜本榮;齊義清;沈力
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中農(nóng)華威生物制藥（湖北）有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/75
• 分類號(hào): C12N15/75;C12N15/67;C12N1/21;C12N9/54;C12R1/125
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 齊寶玲

本發(fā)明公開了一種促表達(dá)元件、重組載體、菌株，促表達(dá)元件由p43啟動(dòng)子、hpall啟動(dòng)子、phod信號(hào)肽組成，還可以包括apre啟動(dòng)子；所述重組表達(dá)載體由phy?p43載體、hpall啟動(dòng)子、Ker基因和phod信號(hào)肽組成，還包括apre啟動(dòng)子；以所述表達(dá)元件或重組表達(dá)載體構(gòu)建菌株，并以該菌株發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶，顯著提升了酶的活力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具地說是涉及一種促表達(dá)元件、重組表達(dá)載體、菌株及應(yīng)用。

背景技術(shù)

角蛋白酶是一種特殊堿性絲氨酸蛋白酶，包含二硫鍵水解酶和多肽水解酶，可高效打開二硫鍵，降解角蛋白、醇溶蛋白、多肽和其他蛋白質(zhì)。角蛋白酶耐酸性好，過胃能力強(qiáng)，在腸道發(fā)揮高效酶活，耐熱性良好，在顆粒料的生產(chǎn)中具有一定的優(yōu)勢(shì)，研究表明，角蛋白酶在不同類型的日糧均可發(fā)揮作用。玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧中添加角蛋白酶可提高肉雞日增重、飼料利用率以及脂肪消化率。小麥-豆粕型基礎(chǔ)日糧中添加角蛋白酶可提高淀粉、脂肪、能量表觀利用率以及氨基酸利用率。角蛋白酶可全方位、高效水解飼料中蛋白質(zhì)，在提升畜禽對(duì)蛋白質(zhì)的消化利用率方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Brevibacillus brevisUS575角蛋白酶最適溫度為40℃，與動(dòng)物腸道環(huán)境相似，有在飼料中應(yīng)用的潛力。

枯草芽孢桿菌是重要的工業(yè)酶蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，具有分泌表達(dá)、無致病性、發(fā)酵技術(shù)成熟等優(yōu)勢(shì)，在酶制劑生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用?？莶菅挎邨U菌是蛋白酶和淀粉酶主要的生產(chǎn)菌株。

啟動(dòng)子是枯草芽孢桿菌高效表達(dá)目的蛋白的關(guān)鍵元件之一，啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度嚴(yán)重影響著外源蛋白的表達(dá)量，啟動(dòng)子分為誘導(dǎo)型、時(shí)期特異型、組成型和自誘導(dǎo)型。組成型啟動(dòng)子是一類能夠持續(xù)表達(dá)目的蛋白，且在發(fā)酵生產(chǎn)過程中不需要添加任何誘導(dǎo)物的啟動(dòng)子。不同的外源蛋白對(duì)啟動(dòng)子的適應(yīng)性不同，因此，改造啟動(dòng)子以實(shí)現(xiàn)目的基因的高效表達(dá)是目前研究的熱點(diǎn)之一。

因此，如何通過改造啟動(dòng)子來構(gòu)建表達(dá)元件、重組表達(dá)載體，進(jìn)而構(gòu)建能夠產(chǎn)角蛋白酶的菌株是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種重組表達(dá)載體，并將載體轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌菌株中，產(chǎn)飼用角蛋白酶，顯著提高了酶活。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種促表達(dá)元件，所述促表達(dá)元件由p43啟動(dòng)子、hpall啟動(dòng)子和phod信號(hào)肽組成。

作為與上述技術(shù)方案相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)一種促表達(dá)元件，所述促表達(dá)元件由p43啟動(dòng)子、hpall啟動(dòng)子、apre啟動(dòng)子和phod信號(hào)肽組成。

作為與上述技術(shù)方案相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體由phy-p43載體、hpall啟動(dòng)子、Ker基因和phod信號(hào)肽組成。

作為與上述技術(shù)方案相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體由phy-p43載體、hpall啟動(dòng)子、apre啟動(dòng)子、Ker基因和phod信號(hào)肽組成。

作為與上述技術(shù)方案相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)一種工程菌株，所述工程菌株任一所述的促表達(dá)元件為表達(dá)元件。

作為與上述技術(shù)方案相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)一種工程菌株，所述工程菌株以任一所述的重組表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)。

作為與上述技術(shù)方案相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)所述的促表達(dá)元件在發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶中的應(yīng)用。

作為與上述技術(shù)方案相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)任一所述的重組表達(dá)載體在發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶中的應(yīng)用。

作為與上述技術(shù)方案相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)任一所述的工程菌株在發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶中的應(yīng)用。