[發(fā)明專利]一種促進人臍帶間充質(zhì)干細胞神經(jīng)分化的方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210675467.0
• 申請日: 2022-06-15
• 公開（公告）號: CN114807036A
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬珊珊;關(guān)方霞;趙化;李喆;楊波;黃團結(jié)
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793;A61K35/30;A61P25/28
• 代理公司: 北京申翔知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11214
• 代理人: 周春發(fā)

本發(fā)明涉及一種促進人臍帶間充質(zhì)干細胞神經(jīng)分化的方法及其應(yīng)用，通過雷帕霉素激活Wnt/β?catenin通路和自噬抑制衰老和凋亡，促進間充質(zhì)干細胞增殖、遷移和神經(jīng)分化，為改善間充質(zhì)干細胞的命運和干細胞治療在退行性疾病中的應(yīng)用提供了新的選擇。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明申請屬于干細胞處理技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種雷帕霉素在人臍帶間充質(zhì)干細胞領(lǐng)域中的應(yīng)用方法及其用途，具體為雷帕霉素促進人臍帶間充質(zhì)干細胞神經(jīng)分化的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有較高的自我更新能力和多重分化能力，在治療阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病方面具有廣闊的前景。然而，體外培養(yǎng)的MSCs可能表現(xiàn)出復(fù)制性衰老，主要表現(xiàn)為細胞活力低、遷移和分化能力降低，直接影響用于細胞移植的效果。體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)向神經(jīng)元樣細胞分化的方法很多。然而，這些分化方案的效率較低。因此，提高MSCs的細胞活力和神經(jīng)分化率是提高干細胞移植效果的關(guān)鍵。

自噬是一種受mTOR信號負調(diào)控的細胞內(nèi)分解代謝機制，通過自我更新、分化等多種機制在維持干細胞穩(wěn)態(tài)和命運中發(fā)揮重要作用。雷帕霉素(Rapamycin,Rap)是一種自噬激活物，也可抑制mTOR信號通路。研究表明，Rap可有效調(diào)節(jié)小鼠胚胎干細胞的心臟分化、肝祖細胞的軟骨分化、脂肪分化和肝分化。此外，自噬在MSCs神經(jīng)元分化過程中被激活。既往研究表明自噬通過調(diào)節(jié)Notch1信號通路促進骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元分化。然而，Rap誘導(dǎo)的自噬在hUC-MSCs增殖和神經(jīng)分化中的作用及其機制尚不清楚。

Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)節(jié)干細胞命運中發(fā)揮重要作用，如自我更新和分化。正常情況下，胞質(zhì)β-catenin與APC、Axin、GSK-3β和CKIε結(jié)合，導(dǎo)致β-catenin降解。Wnt/β-catenin信號通路一旦激活，胞質(zhì)β-catenin轉(zhuǎn)移到細胞核，與LEF1/TCF家族相互作用，誘導(dǎo)下游靶基因CyclinD1、c-Myc表達，調(diào)節(jié)細胞增殖分化。研究表明，自噬可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路促進心臟或肝臟分化過程。但Rap是否能通過Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進hUC-MSCs的神經(jīng)分化還有待進一步研究。

在本發(fā)明中研究了Rap對hUC-MSCs增殖和神經(jīng)分化的影響，并進一步探討了Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和自噬在Rap誘導(dǎo)的神經(jīng)分化中的作用。我們發(fā)現(xiàn)Rap通過抑制Wnt/β-catenin信號通路和激活自噬以劑量依賴的方式促進hUC-MSCs的增殖、遷移和神經(jīng)分化，同時抑制衰老和凋亡。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明以每1-6萬個細胞/孔密度，采用1-20nM濃度的雷帕霉素處理人臍帶間充質(zhì)干細胞，促進人臍帶間充質(zhì)干細胞神經(jīng)分化。

以每1-6萬個細胞/孔密度，采用1-20nM雷帕霉素處理人臍帶間充質(zhì)干細胞，增加人臍帶間充質(zhì)干細胞TuBB3、NSE、NeuN的表達。

以每5-18萬個細胞/孔密度，采用1-20nM濃度的雷帕霉素處理人臍帶間充質(zhì)干細胞提高充質(zhì)干細胞Ngn2、Mash1、TuBB3中一種或多種的mRNA表達，和/或降低人臍帶間充質(zhì)干細胞Ngn1的mRNA表達。

以每5-18萬個細胞/孔密度，采用1-20nM濃度的雷帕霉素處理人臍帶間充質(zhì)干細胞，促進人臍帶間充質(zhì)干細胞中Wnt3a和β-catenin的表達而抑制GSK-3β的表達，從而激活Wnt/β-catenin信號通路，促進人臍帶間充質(zhì)干細胞Wnt/β-catenin信號通路。

逆轉(zhuǎn)雷帕霉素誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞Wnt/β-catenin信號通路的方法，利用XAV-939逆轉(zhuǎn)雷帕霉素對于人臍帶間充質(zhì)干細胞Wnt/β-catenin信號的活化，從而達到抑制雷帕霉素誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞增殖，和/或遷移，和/或神經(jīng)分化，以及促進雷帕霉素誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞的衰老，和/或凋亡。