[發明專利]一種苯乙醇胺-N-甲基轉移酶的高通量篩選方法

在審

• 申請號: 202210670475.6
• 申請日: 2022-06-14
• 公開（公告）號: CN114854822A
• 公開（公告）日: 2022-08-05
• 發明（設計）人: 陳可泉;孫金娣;王昕;馮嬌
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;C12Q1/34;C12N15/70;C12N15/54;C07D311/94
• 代理公司: 南京擎天知識產權代理事務所(普通合伙) 32465
• 代理人: 藍霞

本發明公開了一種苯乙醇胺?N?甲基轉移酶的高通量篩選方法。在酶標儀的96孔板中加入底物去甲腎上腺素和S?腺苷蛋氨酸、PBS緩沖液、S?腺苷?L?同型半胱氨酸水解酶SAHH，加入酶樣品苯乙醇胺?N?甲基轉移酶，在微孔板震蕩反應器中，20?50℃，500?1000rpm，反應1?3h，4℃，3700rpm離心，取上清，再加入化合物NDCC反應0?90min，反應過程中每隔1?30min取出酶標板，酶標測定其吸光值；根據吸光值變化，酶活定義為在特定條件下，每分鐘OD405nm吸光值的變化*1000000。本發明具有操作簡單、成本低廉、檢測準確等特點，對苯乙醇胺?N?甲基轉移酶的定向進化具有深遠意義。

技術領域

本發明涉及高通量篩選技術，具體涉及一種苯乙醇胺-N-甲基轉移酶的高通量篩選方法，屬于生物技術領域。

背景技術

苯乙醇胺-N-甲基轉移酶(phenylethanolamine-N-methyltransferase，PNMT)是催化將甲基從S-腺苷蛋氨酸轉移到去甲腎上腺素的氨基端生成腎上腺素反應的酶。利用苯乙醇胺-N-甲基轉移酶催化去甲腎上腺素合成腎上腺素，反應條件溫和，綠色環保且無污染物生成，在生物催化和生物醫藥領域都有廣泛的應用。

新型酶的發現可以通過自然突變的方法篩選得到，但是這種方法效率低、目標性較差，需建立快速高效的新方法。采用分子改造的方法，篩選獲得新型的苯乙醇胺-N-甲基轉移酶。用分子改造的方法對現有的酶進行突變時，通常會形成數量巨大的文庫，從而高通量檢測方法成為篩選時的關鍵方法。目前使用較普遍的篩選方法為高效液相色譜(HPLC)，該方法分離效率高，選擇性好，檢測靈敏度高，應用范圍廣；但該方法檢測成本高，分析時間較長，不能提高篩選效率。

因此，開發一種高通量篩選苯乙醇胺-N-甲基轉移酶的方法對苯乙醇胺-N-甲基轉移酶的定向進化具有重要意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種高通量篩選苯乙醇胺-N-甲基轉移酶的方法。

為解決上述技術問題，本發明采取如下技術方案：

一種苯乙醇胺-N-甲基轉移酶的高通量篩選方法，在酶標儀的96孔板中加入底物去甲腎上腺素和S-腺苷蛋氨酸、PBS緩沖液、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶SAHH，然后分別加入苯乙醇胺-N-甲基轉移酶樣品與無酶空菌樣品pET24a/E.coli BL21(DE3)的酶液，在微孔板震蕩反應器中，20-50℃，500-1000rpnm，反應1-3h，4℃，3700rpm離心10min，取上清再加入NDCC化合物，反應0-90min，反應過程中每隔1-30分鐘取出96孔板，分別酶標測定其在405nm處的吸光值大小；根據吸光值變化，酶活定義為在特定條件下，每分鐘OD405 nm吸光值的變化*1000000；

所述化合物NDCC的合成方法為：0.1-0.2g的5-硝基水楊醛，0.1-0.2g的2-環戊烯-1-酮和0.05-0.1g的咪唑溶解在四氫呋喃1.5mL與去離子水1.5mL的混合溶液中，20℃下攪拌過夜，之后用去離子水稀釋4.3倍，并用乙酸乙酯萃取，合并有機組分，并用真空抽濾去除乙酸乙酯，然后通過快速色譜純化NDCC。

所述酶樣品為苯乙醇胺-N-甲基轉移酶，酶來源參考專利：一種苯乙醇胺-N-甲基轉移酶hPNMT54及其克隆表達與應用。

本發明所述苯乙醇胺-N-甲基轉移酶的高通量篩選方法，所述的苯乙醇胺-N-甲基轉移酶為催化去基腎上腺素合成腎上腺素的甲基轉移酶。

本發明所述的利用化學合成的NDCC化合物檢測的原理為：苯乙醇胺-N-甲基轉移酶將S-腺苷蛋氨酸的甲基轉移到去甲腎上腺素的氨基端生成腎上腺素，S-腺苷蛋氨酸會生成其副產物S-腺苷同型半胱氨酸，該副產物在S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶(SAHH)水解成腺苷和同型半胱氨酸，NDCC化合物可檢測同型半胱氨酸，于405nm處產生吸光值變化，且由無色變為黃色，檢測較靈敏。