本發明公開了大麗輪枝菌VdNRPS2基因抗病原菌靶基因片段及其干擾載體和應用。本發明提供了大麗輪枝菌VdNRPS2基因抗病原菌靶基因片段，其核苷酸序列分別為SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示。本發明進一步提供了采用所述靶基因片段構建的Gateway干擾載體。本發明提供的大麗輪枝菌VdNRPS2基因抗病原菌靶基因片段以及采用該靶基因片段所構建的Gateway干擾載體能應用于提高作物對大麗輪枝菌所導致病害的抗性以及培育抗大麗輪枝菌的轉基因植物新品種等方面。
技術領域
本發明涉及大麗輪枝菌抗病原菌靶基因片段以及含有所述靶基因片段的RNA干擾載體，尤其涉及大麗輪枝菌VdNRPS2基因抗病原菌靶基因片段以及采用所述抗病原菌靶基因片段構建的RNA干擾載體及其在提高作物或蔬菜抗病性中的應用，屬于大麗輪枝菌抗病原菌靶基因片段及抗病性應用領域。
背景技術
棉花黃萎?。–otton Verticillium Wilt）被稱為“棉花癌癥”，在很多國家使棉花平均減產10-35%，嚴重危害棉花生產，造成了巨大的經濟損失。其致病菌為大麗輪枝菌（Verticillium dahliae），它具有很強的致病性，在整個棉花生長階段內，它都能夠進行侵染，導致棉花出現葉片萎蔫、變黃等現象；發病嚴重時，整個棉花葉片枯焦破碎，最終死亡。同時，它的寄主植物范圍較為廣泛，能夠侵染的植物種類達六百多種，包括一年生草本植物、多年生草本植物和木本植物，其中不乏十字花科、茄科、菊科和薔薇科等多種具有重要經濟價值的農作物、苗木和花卉等，并且可侵染的寄主的范圍還在不斷擴大。由于大麗輪枝菌是土傳植物病原真菌，防治困難，目前生產上還沒有具有效果較好的防治藥劑。
絲狀真菌可以通過非核糖體途徑合成一系列低分子量的具有藥用價值的多肽類次級代謝產物，這種結構復雜、種類繁多的多肽類化合物統稱為非核糖體肽（non-ribosomal peptides，NRP）。 目前發現的非核糖體肽中超過80%來自于真菌和放線菌,其次是粘細菌和藍藻等單細胞原核生物?；蚪M序列分析結果表明,古生菌、后生動物和甲藻也有合成非核糖體肽的潛力（Wang H, Fewer D P, Holm L, et al. Atlas ofnonribosomal peptide and polyketide biosynthetic pathways reveals commonoccurrence of nonmodular enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111(5): 9259- 9264.）。它們具有抗菌、抗病毒和抗癌等多種生物活性，目前已經得到了廣泛的應用。NRP主要是由非核糖體肽合成酶（NRPS）催化形成，第一個被鑒定的NRPS是L‐氨基己二酰‐L‐半胱氨酸‐D‐纈氨酸合酶，它催化β‐內酰胺類抗生素生物合成的第一步反應，將3個氨基酸縮合成一個三肽化合物進而形成青霉素等β‐內酰胺抗生素（Smith D J, Burnham M K R, Bull J H, et al.Beta-lactam antibiotic biosynthetic genes have been conserved in clusters inprokaryotes and eukaryotes. Embo Journal, 1990,9(3)): 741- 747.）。NRPS具有多種生理功能，可作為抗生素（antibiotics）抑制同自身進行營養物質競爭的競爭者；也可作為毒素（toxins），在病原菌侵入寄主并定殖的過程中扮演著重要的角色；還有一些可以作為鐵載體（siderophores）參與微生物生長，還可作為儲存含氮物質的場所或作為信號因子，調節微生物的生長、繁殖以及分化等。有些NRPS還與其他酶系如聚酮類（polyketide）或萜類（terpenoid）合成酶系共同完成雜合分子的合成。典型的NRPS由多個模塊（module）組成，這些模塊按特定的空間順序排列,每個模塊由多個功能結構域（domain）或催化單元組成,結構多樣的非核糖體肽在這些模塊及其結構域上有序地進行合成。近期玉米小斑病菌（Cochliobolus heterostrophus）全基因組測序數據顯示，玉米小斑病菌中編碼NRPS的基因有12個，其中，NPS6作為玉米小斑病中的典型的毒力決定因子，不僅參與其致病還參與對H2O2的耐受性，是玉米病原菌（Cochliobolus miyabeanus）的毒力決定因素，與H2O2的耐受性有關。水稻病原菌宮部旋孢腔菌（Cochliobolus miyabeanus），小麥赤霉病病原菌禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和擬南芥病原菌（Alternaria brassicicola）中與NPS6同源基因的缺失也會導致它們相對應的毒力下降和對H2O2的耐受性變差（Oide S, Moeder W,Krasnoff S , et al. NPS6, encoding a nonribosomal peptide synthetase involvedin siderophore-mediated iron metabolism, is a conserved virulence determinantof plant pathogenic ascomycetes. Plant Cell, 2006, 18(10): 2836- 2853. ）。
