[發(fā)明專利]SARS-CoV-2中和性納米抗體、自組裝鐵蛋白融合納米抗體及制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210663315.9
• 申請(qǐng)日: 2022-06-14
• 公開（公告）號(hào): CN114736293B
• 公開（公告）日: 2022-09-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李軼女;張志芳;劉興健;高新桃;易詠竹;王海寧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C07K16/10
• 分類號(hào): C07K16/10;C07K19/00;C12N15/13;C12N15/62;C12N15/70;C12N15/866;A61K39/42;A61P31/14
• 代理公司: 北京思元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍

本發(fā)明公開了SARS?CoV?2中和性納米抗體、自組裝鐵蛋白融合納米抗體及制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明首先提供了氨基酸序列為SEQ ID NO.1所示的SARS?CoV?2中和性納米抗體，將該其與鐵蛋白的C端融合得到自組裝鐵蛋白融合納米抗體，電鏡觀察證實(shí)其展示在自組裝鐵蛋白籠形結(jié)構(gòu)表面。本發(fā)明進(jìn)一步將這些納米抗體進(jìn)行突變優(yōu)化以提高其表達(dá)量和表達(dá)效率并提高其對(duì)假病毒的中和活性。本發(fā)明利用原核表達(dá)系統(tǒng)、真核表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)納米抗體融合蛋白。本發(fā)明提供的自組裝鐵蛋白融合納米抗體顆粒在細(xì)胞水平上對(duì)SARS?CoV?2假病毒具有較強(qiáng)的中和能力，具有成為一種低成本、高中和活性的新冠病毒診斷和治療藥物的潛力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及新型冠狀病毒抗體，尤其涉及SARS-CoV-2中和性納米抗體以及由SARS-CoV-2中和性納米抗體和單體鐵蛋白亞基融合在一起得到的自組裝鐵蛋白融合納米抗體及其制備方法和應(yīng)用，屬于新型冠狀病毒抗體領(lǐng)域。

背景技術(shù)

新型冠狀病毒病（Corona virus disease 2019，COVID-19）的致病物是嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 ,SARS-CoV-2），病毒通過(guò)S蛋白（spike protein）上的受體結(jié)合域RBD（Receptor bindingdomain）與細(xì)胞受體ACE2（Angiotensin-converting enzyme 2）結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞，感染人體后能夠引起包括呼吸道疾病在內(nèi)的全身?yè)p傷。針對(duì)COVID-19的常規(guī)藥物如α-干擾素、糖皮質(zhì)激素、洛匹那韋和利托那韋聯(lián)合用藥等往往會(huì)產(chǎn)生一定的副作用，因此安全、高效的抗SARS-CoV-2藥物的開發(fā)具有重要的意義。

納米抗體( nanobody，Nb)作為小分子抗體的成員之一，與傳統(tǒng)的抗體相比免疫原性更弱、穿透性更強(qiáng)、穩(wěn)定性更好且對(duì)抗原的親和力更高，針對(duì)S蛋白的納米抗體可以特異性靶向新冠病毒S蛋白的受體結(jié)合域RBD，阻止其與細(xì)胞膜受體ACE2結(jié)合。鐵蛋白（ferritin）能夠自組裝形成天然的蛋白納米籠，整個(gè)籠狀結(jié)構(gòu)內(nèi)徑約為8nm，外徑約為12nm，其在蛋白展示、抗原呈遞、藥物靶向輸送等方面具有良好的應(yīng)用前景。如果將納米抗體與鐵蛋白相融合，利用其自組裝的特性，使納米抗體以24聚體的形式展示在鐵蛋白表面，可以有效提高納米抗體對(duì)S蛋白的靶向親和力從而提高其中和活性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種SARS-CoV-2中和性納米抗體；

本發(fā)明的目的之二是將SARS-CoV-2中和性納米抗體進(jìn)行突變得到表達(dá)量或抗體中和活性提高的突變體；

本發(fā)明的目的之三是將SARS-CoV-2中和性納米抗體或SARS-CoV-2中和性納米抗體的突變體與單體鐵蛋白亞基融合在一起得到的自組裝鐵蛋白融合納米抗體；

本發(fā)明的目的之四是將自組裝鐵蛋白融合納米抗體進(jìn)行突變得到抗體中和活性提高的突變體；

本發(fā)明的目的之五是提供制備所述SARS-CoV-2中和性納米抗體的突變體以及自組裝鐵蛋白融合納米抗體的方法。

本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明首先提供了SARS-CoV-2中和性納米抗體，其氨基酸序列為SEQ ID NO.1所述。

本發(fā)明利用OptimumGene^TM技術(shù)，根據(jù)大腸桿菌與家蠶密碼子偏好性，對(duì)編碼SEQID NO.1所述蛋白的核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化改造，對(duì)影響基因轉(zhuǎn)錄效率、翻譯效率和蛋白折疊的GC含量、CpG二核苷酸含量、密碼子偏好性、mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)、mRNA自由能穩(wěn)定性、RNA不穩(wěn)定性基因序列、重復(fù)序列等多種相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，并保持最終翻譯成的蛋白序列不變，優(yōu)化后的編碼基因的核苷酸序列分別為SEQ ID NO.2所示。