[發(fā)明專利]SA-MBD重組蛋白以及表達(dá)方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210660960.5
• 申請(qǐng)日: 2022-06-13
• 公開（公告）號(hào): CN115286718A
• 公開（公告）日: 2022-11-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉云龍;顧月清;譚書琳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國藥科大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C07K1/14;C07K1/22;C12Q1/02;G01N21/64;C12R1/19
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 吳爽;徐冬濤

1.SA-MBD重組蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO ：1 所示。

2.編碼SA-MBD重組蛋白的基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO ：2 所示。

4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組工程菌。

5.一種SA-MBD重組蛋白的表達(dá)方法，其特征在于，人工合成編碼SA-MBD的DNA，克隆至原核表達(dá)載體pET-30a(+)，轉(zhuǎn)化大腸肝菌BL21（DE3），以IPTG在37℃誘導(dǎo)表達(dá)，通過鎳柱親和純化，以獲得和甲基化DNA高親和力的SA-MBD重組蛋白。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的SA-MBD重組蛋白的表達(dá)方法，其特征在于，主要步驟如下：

（1）人工合成目的蛋白SA-MBD的編碼基因；

（2）將步驟（1）中合成的SA-MBD蛋白的編碼基因構(gòu)建到大腸桿菌表達(dá)載體中，以獲得重組表達(dá)載體；

（3）用步驟（2）中所得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞，獲得重組基因工程菌；

（4）用步驟（3）中的重組基因工程菌作為生產(chǎn)菌株，加入IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)8h；

（5）用步驟（4）中的菌體超聲，離心，上清上樣于鎳柱，親和純化目的蛋白，并通過重力脫鹽柱將咪唑等小分子物質(zhì)除去。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的SA-MBD重組蛋白的表達(dá)方法，其特征在于，表達(dá)載體為pET30a(+)。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的SA-MBD重組蛋白的表達(dá)方法，其特征在于，

所述SA序列包括160個(gè)氨基酸，序列SEQ ID NO：3所示；

所述MBD序列包括112個(gè)氨基酸，序列SEQ ID NO：4所示；

所述接頭序列包括20個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID NO：5所示；

所述分離純化標(biāo)簽序列標(biāo)簽包含6個(gè)組氨酸，序列如SEQ ID NO：6所示。

9.權(quán)利要求1所述的重組蛋白，和/或，權(quán)利要求2或3所述的基因，和/或，含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組工程菌在原位檢測甲基化DNA中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，包括如下具體步驟：

（1）先培養(yǎng)A549細(xì)胞15 h；

（2）PBS溶液清洗細(xì)胞兩次；

（3）用2 mL胰蛋白酶消化細(xì)胞10 min，1000 rpm離心5 min，1mL 1% Triton X-100 的75 mM KCl溶液重懸A549細(xì)胞；

（4）取200 μL重懸液平鋪于載玻片上，風(fēng)干；

（5）取20 μL濃度為1 μM的SA-MBD重組蛋白于載玻片上，孵育3 h；

（6）PBS沖洗1 min后，取20 μL 1.5 μM的Biotin-FITC于載玻片上，孵育2 h；

（7）PBS沖洗1 min后，取20 μL DAPI溶液于載玻片上進(jìn)行復(fù)染；

（8）使用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行成像。