[發(fā)明專利]一種糙海參SSR標記及其擴增引物、檢測方法和應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210657315.8
• 申請日: 2022-06-10
• 公開（公告）號: CN115029448A
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發(fā)明（設計）人: 孫紅巖;楊韻;秦啟偉;于宗赫;何家揚;朱正;羅浩;黃煒;張彤;梁浚嘉;梁鈞翰
• 申請（專利權）人: 華南農業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

1.一種糙海參SSR標記，其特征在于，所述的SSR標記包括以下的一組或多組：HS-1、HS-2、HS-3、HS-4、HS-5和HS-6；

所述的HS-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的HS-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的HS-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述的HS-4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述的HS-5的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述的HS-6的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.一種權利要求1所述的糙海參SSR標記的擴增引物，其特征在于，所述的擴增引物包括以下的一組或多組：

針對HS-1位點：

F：5'-TGAGCTGAGCCAATGCAGAA-3'；

R：5'-GATTGCTCCGTGCCCAGT-3'；

針對HS-2位點：

F：5'-CGGCAAAGTTGACAGCATCC-3'；

R：5'-GCGTCATAGCTCCATGTGGA-3'；

針對HS-3位點：

F：5'-CAAGAGGCGACTAAACGGGA-3'；

R：5'-TGTCAAGACTTGGCAGGCAT-3'；

針對HS-4位點：

F：5'-TGACTGACTTGTCGACCGAC-3'；

R：5'-CAGCCGTGAGCCCTCAATTA-3'；

針對HS-5位點：

F：5'-GCGGCAGGCATTTACATGTT-3'；

R：5'-TTTCAGGGTGGGCCAAATGT-3'；

針對HS-6位點：

F：5'-AAGCCAGTGAGTCACGACTG-3'；

R：5'-CGGTCCAAGACACGATGACA-3'。

3.根據(jù)權利要求2所述的擴增引物，其特征在于，所述的擴增引物的正向引物的5'端標記有熒光基團。

4.根據(jù)權利要求3所述的擴增引物，其特征在于，所述的熒光基團為ROX、FAM、HEX或TAMRA。

5.一種糙海參SSR標記的檢測試劑盒，其特征在于，包含權利要求2、3或4所述的擴增引物。

6.一種基于權利要求1所述的糙海參SSR標記對糙海參種群遺傳多樣性的評估方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)收集糙海參群體樣本，提取糙海參個體DNA；

(2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，利用權利要求2所述的針對HS-1位點的引物對F/R、針對HS-2位點的引物對F/R、針對HS-3位點的引物對F/R、針對HS-4位點的引物對F/R、針對HS-5位點的引物對F/R、針對HS-6位點的引物F/R中的一組或多組進行PCR擴增；

(3)對步驟(2)擴增的PCR產(chǎn)物進行分型；

(4)對步驟(3)獲得的分型結果進行遺傳多樣性分析。

7.根據(jù)權利要求6所述的評估方法，其特征在于，步驟(2)所述的PCR擴增，其反應體系25L，包括：不含Mg²⁺的10×PCR buffer 2.5L、25mM MgCl₂ 2.0L、10mM dNTP 0.5L、高保真PCR酶1U、10μM正向引物0.5L、10μM反向引物0.5L、DNA模板12.5ng，其余由無菌雙蒸水補足至25L；

所述的PCR擴增，其反應程序為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個循環(huán)；72℃再延伸5分鐘。

8.根據(jù)權利要求6所述的評估方法，其特征在于，步驟(3)所述的電泳分型，6對多態(tài)性SSR標記引物的5’端標記FAM熒光基團，并利用基因型分型測序儀進行毛細管電泳分型。