[發明專利]一種魚類細胞體外三維培養、誘導分化和冷凍保存方法

在審

• 申請號: 202210653341.3
• 申請日: 2022-06-09
• 公開（公告）號: CN115011546A
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 畢世超;袁世鵬;孫申杰
• 申請（專利權）人: 青島海洋科學與技術國家實驗室發展中心
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0735;A01N1/02
• 代理公司: 青島聯智專利商標事務所有限公司 37101
• 代理人: 宋蓮英

1.一種魚類細胞體外三維培養、誘導分化和冷凍保存方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)取熱可逆聚合物，添加于魚類細胞溶劑中，于0-13℃下，溶解0.5-12h，得熱可逆水凝膠，熱可逆水凝膠的質量濃度為0.5-15％；

2)將步驟1)所得的熱可逆水凝膠，在0-13℃下，添加魚類細胞，共混1-5min，魚類細胞的密度為10²-10⁶個/mL，升溫至14-38℃，得魚類細胞三維培養水凝膠體系；

3)在步驟2)所得的魚類細胞三維培養水凝膠體系中添加完全培養基進行培養或誘導分化，或將步驟2)所得的魚類細胞三維培養水凝膠體系進行冷凍保存。

2.根據權利要求1所述的魚類細胞體外三維培養、誘導分化和冷凍保存方法，其特征在于：

所述步驟1)中，魚類細胞溶劑為MEM、DMEM、Leibowitz L-15和M199中的任意一種或幾種。

3.根據權利要求2所述的魚類細胞體外三維培養、誘導分化和冷凍保存方法，其特征在于：

所述魚類細胞溶劑為DMEM和Leibowitz L-15按照體積比為70-90:10-30組成的混合物；

或者，所述魚類細胞溶劑為MEM和M119按照體積比為60-85:15-40組成的混合物。

4.根據權利要求1所述的魚類細胞體外三維培養、誘導分化和冷凍保存方法，其特征在于：

所述熱可逆水凝膠的凝膠化溫度為14-38℃，凝膠化時間為30-200s。

5.根據權利要求1所述的魚類細胞體外三維培養、誘導分化和冷凍保存方法，其特征在于：

所述熱可逆聚合物的分子量為2-1500KDa；

優選地，所述熱可逆聚合物的分子量為150-800KDa。

6.根據權利要求1所述的魚類細胞體外三維培養、誘導分化和冷凍保存方法，其特征在于：

所述熱可逆聚合物為羥丁基殼聚糖、羥丁基甲殼素、羥丙基殼聚糖、膠原蛋白、明膠、嵌段共聚物中的任意一種或幾種。

7.根據權利要求6所述的魚類細胞體外三維培養、誘導分化和冷凍保存方法，其特征在于：

所述熱可逆聚合物為羥丁基殼聚糖和明膠按照質量比為1-5:0.5-5組成的混合物；

或者，所述熱可逆聚合物為羥丁基殼聚糖和膠原蛋白按照質量比為1-5:0.2-2組成的混合物；

或者，所述熱可逆聚合物為嵌段共聚物和膠原蛋白按照質量比為3-10:0.5-5組成的混合物；

或者，所述熱可逆聚合物為嵌段共聚物和明膠按照質量比為3-10:2-8組成的混合物。

8.根據權利要求6所述的魚類細胞體外三維培養、誘導分化和冷凍保存方法，其特征在于：

所述熱可逆聚合物為羥丁基殼聚糖、膠原蛋白與明膠按照質量比為0.5-5:0.2-10:0.5-10組成的混合物。

9.根據權利要求1-8中任意一項所述的可魚類細胞體外三維培養、誘導分化和冷凍保存方法，其特征在于：

所述魚類細胞為青魚細胞、草魚細胞、鯉魚細胞、真鯛魚細胞、鱸魚細胞、大菱鲆魚細胞、赤點石斑魚細胞中的任意一種。

10.根據權利要求1所述的魚類細胞體外三維培養、誘導分化和冷凍保存方法，其特征在于：

在所述步驟3)之后還包括：移除培養和誘導分化完成之后的完全培養基，或者，在冷凍保存完成之后，復蘇，于0-13℃下，靜置30-300s，于800-2000r/min轉速下，離心2-6min，得目標細胞。