[發(fā)明專利]一種免PAM序列的DNA分子機(jī)器用于檢測新冠病毒的方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210652329.0
• 申請日: 2022-06-10
• 公開（公告）號: CN115058416A
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 史鎧;易志剛;宋九華
• 申請（專利權(quán)）人: 樂山師范學(xué)院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6806;C12Q1/6825;C12Q1/682;C12Q1/70;C12N15/113;C12R1/93
• 代理公司: 成都玖和知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51238
• 代理人: 胡琳梅

1.一種免PAM序列的DNA分子機(jī)器，其特征在于，所述DNA分子機(jī)器的制備方法包括將DNA1/DNA2/DNA3探針、SARS-CoV-2的RdRp基因與燃料探針經(jīng)級聯(lián)toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)(TSDR)獲得；

所述DNA1/DNA2/DNA3探針為DNA1、DNA2和DNA3形成的探針，序列分別如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；所述燃料探針的序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子機(jī)器，其特征在于，所述DNA1/DNA2/DNA3探針的制備方法包括：將DNA1、DNA2和DNA 3的混合物在95℃下退火5分鐘，并緩慢冷卻獲得。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子機(jī)器，其特征在于，所述級聯(lián)TSDR使用的緩沖液為Tris-HCl、PBS或HEPES緩沖液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子機(jī)器，其特征在于，所述級聯(lián)TSDR使用了不同濃度的所述SARS-CoV-2的RdRp基因，所述SARS-CoV-2的RdRp基因的濃度范圍為100aM-10pM。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子機(jī)器，其特征在于，所述DNA1、DNA2和DNA3探針的摩爾比為1：1-1.5：1-2。

6.一種檢測SARS-CoV-2的方法，其特征在于，所述方法包括：將權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的一種免PAM序列的DNA分子機(jī)器與CRISPR-Cas12a系統(tǒng)耦合，檢測SARS-CoV-2的RdRp基因。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種檢測SARS-CoV-2的方法，其特征在于，所述DNA分子機(jī)器與CRISPR-Cas12a系統(tǒng)耦合后，還和等溫信號放大相結(jié)合。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種檢測SARS-CoV-2的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas12a系統(tǒng)包括Cas12a-gRNA復(fù)合物，所述Cas12a-gRNA復(fù)合物的制備方法包括：將Cas12a與gRNA孵育獲得；所述gRNA的序列如SEQ ID NO.6所示。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種檢測SARS-CoV-2的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas12a系統(tǒng)包括MCH/探針/AuE，所述MCH/探針/AuE的制備方法包括：將AuE與亞甲基藍(lán)修飾的發(fā)夾DNA共同孵育，再浸入MCH中獲得；所述發(fā)夾DNA的序列如下：SH-(CH2)₆-TCAGCGTTCCTTTACCATTTTTTTAACTTATTTGGTTTTTTTTTT-MB。

10.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的一種免PAM序列的DNA分子機(jī)器或權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的一種檢測SARS-CoV-2的方法用于檢測SARS-CoV-2的應(yīng)用。