[發明專利]一種鑒定煙草腺毛密度的DNA分子標記及其應用

在審

• 申請號: 202210647929.8
• 申請日: 2022-06-08
• 公開（公告）號: CN115011721A
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 田濤;楊永鋒;馬一瓊;王召軍;劉茂林;蘆昶彤;楊欣玲
• 申請（專利權）人: 河南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京維澳專利代理有限公司 11252
• 代理人: 隋勤

1.一種鑒定煙草腺毛密度的分子標記的引物，其特征在于，所述引物包括以下上游引物和下游引物：

上游引物W12-seq-F：5’-GACAGGGGAGATTATTCAAAA-3’；

上游引物W12-WT-F：5’-CACCACGAGTGATCAACCACC-3’；

公共下游引物W12-R：5’-TTGAAAAACAGGGCTAGAGGG-3’。

2.一種包含權利要求1所述的鑒定煙草腺毛密度的分子標記的引物的試劑盒。

3.一種鑒定煙草腺毛密度的分子標記的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)引物組合成：合成如權利要求書1所述的引物W12-seq-F、W12-WT-F以及W12-R；

(2)DNA的提取：提取煙草葉片的基因組DNA；

(3)PCR擴增：基于上述煙草葉片基因組DNA，使用步驟(1)合成的引物進行PCR擴增，引物組合分別為W12-seq-F+W12-R和W12-WT-F+W12-R，預先加入兩個已經確定為高腺毛密度和低腺毛密度且基因序列已知的樣本DNA作為對照；

(4)擴增產物檢測與分析：

直接測序：對于W12-seq-F+W12-R引物組合擴增的產物，直接進行測序，若所測DNA片段135-141bp位置的7-bp缺失，即與SEQ ID NO.4序列相同，則為高腺毛密度單株；若所測DNA片段135-141bp位置的沒有缺失，即與SEQ ID NO.5序列相同，則為低腺毛密度單株；若測序峰圖為套峰，為低腺毛密度單株；

瓊脂糖凝膠檢測：對于W12-WT-F+W12-R引物組合的擴增產物進行瓊脂糖凝膠檢測，若W12-WT-F+W12-R引物組合不能擴增出條帶，則為高腺毛密度單株；若W12-WT-F+W12-R引物組合能擴增出條帶，則為低腺毛密度單株。

4.根據權利要求3所述的鑒定煙草腺毛密度的分子標記的方法，其特征在于，步驟(3)中PCR擴增反應體系為：50ng/μL的樣品基因組DNA模板1.0μL，2×EASY Taq mix 10μL，10μM的上下游引物各0.4μL，ddH₂O補足至20μL。

5.根據權利要求3所述的鑒定煙草腺毛密度的分子標記的方法，其特征在于，步驟(3)中PCR擴增程序為：95℃預變性5min，然后95℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s，共35個循環，最后72℃ 10min。

6.一種根據權利要求1所述的引物、根據權利要求2所述試劑盒或根據權利要求3-5任一所述的方法在煙草育種中的應用。

7.一種根據權利要求1所述的引物、根據權利要求2所述試劑盒或根據權利要求3-5任一所述的方法在篩選煙草不同腺毛密度單株中的應用。