[發明專利]一種LAMP-Taqman檢測雞毒支原體的引物和探針及其應用

在審

• 申請號: 202210646129.4
• 申請日: 2022-06-08
• 公開（公告）號: CN114959081A
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 董振國;時國強;劉昱;焦義然;石磊
• 申請（專利權）人: 河北三獅生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/35
• 代理公司: 河北國維致遠知識產權代理有限公司 13137
• 代理人: 任青

1.一種LAMP-Taqman檢測雞毒支原體的引物和探針，其特征在于，包括：

內引物FIP：5′-CCGCCATTCATACCACCACTAAAGCCTGAACCAAAACCA-3′；

內引物BIP：5′-GGAATGGATAATGCTGCTCCACACCAACTTTTTCAGTTTGACCAT-3′；

外引物F3：5′-CTGAACCAAAGCCAAATCC-3′；

外引物B3：5′-GTCTTTGATTTTTGCATAGTCAT-3′；

環引物LF：5′-GGAGGGTTTGGCATCGGATC-3′；

環引物探針LBP：5′-AGCAGCTGCTAAAACAGCTTTGA-3′。

2.如權利要求1所述的引物和探針，其特征在于，所述環引物探針LBP的5′端標記有熒光基團，3′端標記有淬滅基團。

3.如權利要求2所述的引物和探針，其特征在于，所述環引物探針LBP為：5′-FAM-AGCAGCTGCTAAAACAGCTTTGA-3′BHQ。

4.權利要求1-3任一項所述的引物和探針在非診斷性檢測雞毒支原體中的應用。

5.一種用于檢測雞毒支原體的試劑盒，其特征在于，包含權利要求1-3任一項所述的引物和探針。

6.如權利要求5所述的用于檢測雞毒支原體的試劑盒，其特征在于，還包括基礎緩沖液、氯化鉀溶液、硫酸銨溶液、吐溫20、DNA聚合酶、甜菜堿、硫酸鎂溶液、dTNPs和去離子水。

7.利用權利要求5所述的試劑盒檢測雞毒支原體的方法，其特征在于，具體操作為：提取雞毒支原體的核酸為模板，用所述試劑盒進行LAMP擴增，并在擴增過程中進行實時熒光檢測。

8.如權利要求7所述的檢測雞毒支原體的方法，其特征在于：所述LAMP擴增的體系包括以下試劑及用量：pH8.8Tris-HCl 20mmol，KCl 10mmol，(NH₄₎₂SO₄ 10mmol，吐溫20 0.024μL，Bst DNA polymerase large fragment 8U，Taq DNA polymerase 5U，甜菜堿1mol，MgSO₄8mmol，dNTPs 1.6mmol，內引物FIP 2.0μmol，內引物BIP 2.0μmol，外引物F3 0.5μmol，外引物B3 0.5μmol，環引物LF 0.5μmol，環引物探針LBP 0.5μmol，去離子水補足至24μL。

9.如權利要求7所述的檢測雞毒支原體的方法，其特征在于：所述LAMP擴增的反應溫度為62℃-64℃，反應時間為45-50min。

10.如權利要求9所述的檢測雞毒支原體的方法，其特征在于：所述LAMP擴增的反應溫度為63℃，反應時間為45min。