[發明專利]一種基于糞便總DNA應用于不同遺傳分析的可行性評估方法

在審

• 申請號: 202210639547.0
• 申請日: 2022-06-08
• 公開（公告）號: CN114990201A
• 公開（公告）日: 2022-09-02
• 發明（設計）人: 徐艷春;崔靚玉;楊淑慧;劉博洋;蘭天明;李曉平;劉歡;張小芳;李海盟;朱翌馨;張樂
• 申請（專利權）人: 東北林業大學;深圳華大生命科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/689;C12Q1/6888;G16B20/40;G16B20/10;G16B20/20;G16B25/20;G16B30/10;G16B30/20
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

1.一種基于糞便總DNA應用于不同遺傳分析的可行性評估方法，其特征在于，所述不同遺傳分析為SNP分析、STR分型、基于高通量測序的線粒體基因組組裝和全基因組重測序，所述可行性評估方法適用于來源于不同物種、不同質量的糞便中提取到的總DNA，具體方法包括如下步驟：

(1)采取絕對熒光定量PCR檢測技術對糞便總DNA中的細菌DNA和宿主DNA的拷貝數進行精準測定；所述宿主DNA為mtDNA和nuDNA；

(2)以宿主DNA與細菌DNA拷貝數的比值作為質控指標，建立質控指標與不同遺傳分析場景下的實驗成功率之間的關系模型，用于評估糞便總DNA在不同遺傳分析場景中的可行性。

2.根據權利要求1所述的可行性評估方法，其特征在于，步驟(1)選用16S rRNA基因、ND5基因和RPS27A基因分別作為絕對熒光定量PCR檢測中細菌DNA、宿主mtDNA和宿主nuDNA的檢測基因。

3.根據權利要求2所述的可行性評估方法，其特征在于，針對16S rRNA基因設計的細菌DNA通用引物為核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Bc-16sR1和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的Bc-16sR2。

4.根據權利要求2所述的可行性評估方法，其特征在于，針對ND5基因設計的宿主mtDNA通用引物為核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的Mt-ND51和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的Mt-ND52。

5.根據權利要求2所述的可行性評估方法，其特征在于，針對RPS27A基因設計的宿主nuDNA通用引物為核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的Nu-S27A1和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的Nu-S27A2。

6.根據權利要求3-5任意一項所述的可行性評估方法，其特征在于，步驟1)中針對三對引物Bc-16sR1/Bc-16sR2、Mt-ND51/Mt-ND52、Nu-S27A1/Nu-S27A建立的絕對熒光定量PCR反應體系為10μL，組成為1μL DNA模板、5μL TB Green Premix ExTaqII、濃度為10μmol/L的上下游引各0.4μL以及3.2μL去離子水。

7.根據權利要求3-5任意一項所述的可行性評估方法，其特征在于，步驟1)中針對三對引物Bc-16sR1/Bc-16sR2、Mt-ND51/Mt-ND52、Nu-S27A1/Nu-S27A2建立的絕對熒光定量PCR反應條件為：95℃/5min；95℃/10s，56℃/30s，72℃/30s，進行40個循環；95℃/10s，65℃/5s，95℃/15s。

8.根據權利要1所述的可行性評估方法，其特征在于，步驟(2)所述由宿主DNA與細菌DNA拷貝數的比值構成的質控指標為宿主mtDNA的相對豐度R_mtDNA以及宿主nuDNA的相對豐度R_nuDNA，分別對應著糞便總DNA中對于宿主mtDNA和宿主nuDNA富集的效率。

9.根據權利要求8所述的可行性評估方法，其特征在于，R_mtDNA的計算方法為：R_mtDNA＝C_mt/C_bc，其中，C_mt為引物Mt-ND51/Mt-ND52擴增產物的拷貝數，C_bc為引物Bc-16sR1/Bc-16sR2擴增產物的拷貝數；R_nuDNA的計算方法為：R_nuDNA＝C_nu/C_bc，其中，C_nu為引物Nu-S27A1/Nu-S27A擴增產物的拷貝數，C_bc為引物Bc-16sR1/Bc-16sR2擴增產物的拷貝數。

10.根據權利要求9所述的可行性評估方法，其特征在于，質控指標與不同遺傳分析場景下的實驗成功率之間的關系模型具體如下：

以糞便總DNA為模板進行SNP分析時，SNP位點擴增成功率S_SNP與R_nuDNA之間的關系模型為：S_SNP＝56.90+43.10×(1-exp(-R_nuDNA/0.014))，當R_nuDNA達到E-01數量級時，SNP位點擴增成功率可達100％；

以糞便總DNA為模板進行STR分型時，STR位點擴增成功率S_STR與R_nuDNA之間的關系模型為：S_STR＝exp(4.62-0.005/(R_nuDNA+0.0014))，當R_nuDNA達到E-01數量級時，STR位點擴增成功率達到80％以上，而R_nuDNA達到E+00數量級及以上時，STR位點擴增成功率可達100％；

以糞便總DNA為模板進行高通量測序時，當R_mtDNA達到E-01數量級及以上時，可以穩定實現線粒體基因組的完整組裝；

以糞便總DNA為模板進行高通量測序時，R_nuDNA和樣本序列與參考基因組的比對率(R_map)之間的關系模型為：R_map＝313.77×R_nuDNA^0.36，當R_nuDNA達到E-01數量級及以上時，R_map與采用高質量模板相近。