[發明專利]熵驅動DNA鏈置換四面體的microRNA檢測方法及其應用

有效

• 申請號: 202210636342.7
• 申請日: 2022-06-07
• 公開（公告）號: CN114934046B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 陽莎;詹新宇;陳鳴;唱凱;羅潔;陳志國;王彬潘;趙爽;湯曉琦
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6806;C12Q1/682;C12Q1/6886
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 黃明光

本發明提供了熵驅動DNA鏈置換四面體的microRNA檢測方法及其應用，涉及microRNA檢測技術領域。本發明提供了熵驅動DNA四面體納米探針，由P1?P6六條單鏈DNA通過堿基互補配對得到。本發明利用DNA四面體的一條邊作為雙鏈復合體，一個頂點自組裝燃料鏈，以DNA四面體作為穿膜載體，以熵驅動DNA鏈置換動態回路實現細胞內靶標microRNA的無酶恒溫級聯放大，可以實現細胞內單個分子在微?納尺度的原位在體檢測，具有良好的靈敏度和特異性。

技術領域

本發明涉及microRNA檢測技術領域，具體涉及熵驅動DNA鏈置換四面體的microRNA檢測方法及其應用。

背景技術

microRNA(miRNA)是一類內源性非編碼單鏈RNA分子，在細胞分化和疾病發展中發揮著重要作用。大量研究表明，miRNA的異常表達與許多嚴重危害健康的惡性疾病密切相關，包括癌癥、心腦血管疾病和代謝類疾病等。隨著體外診斷(In-vitro diagnosis，IVD)技術和納米生物技術等新興技術的迅速發展，研究人員逐漸意識到miRNA在惡性腫瘤早期篩查中作為一些特異性和敏感性較差的傳統蛋白生物標志物的優秀替代品具有巨大的潛力。組織中存在豐富的miRNA，在體液(血漿、尿液、腹膜液和唾液等)中也存在微量的循環miRNA。不同疾病具有不同的miRNA表達譜，因此，準確檢測miRNA的水平對腫瘤的早期診斷具有良好的前景，對有效的治療管理和預后至關重要。

由于miRNA在體液中的含量較低，且由于序列較短導致不同類型的miRNA堿基序列相似度較高，因此，足夠的敏感性和優良的特異性是構建miRNA傳感方法的首要前提。傳統的miRNA檢測方法，如實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerasechain reaction，qRT-PCR)、northernblotting和寡核苷酸芯片等，由于耗時、儀器試劑昂貴、需要核酸酶、需要熱循環等因素限制，阻礙了其在生物醫學領域的廣泛應用。因此，建立一種無酶、恒溫、靈敏度高、特異度強的microRNA檢測方法顯得很有必要。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種熵驅動DNA四面體納米探針，可作為穿膜載體，以熵驅動DNA鏈置換動態回路實現細胞內靶標microRNA的無酶恒溫級聯放大，在無酶恒溫的情況下，即可完成對microRNA細胞內外的高靈敏、高特異性檢測。

為解決上述技術問題，本發明提供了以下技術方案：

本發明提供了一種熵驅動DNA四面體納米探針，所述DNA四面體納米探針由一條含DNA識別序列的單鏈DNA P3和五條單鏈DNAP1、P2、P4、P5、P6構成，所述的DNA識別序列能夠與待測microRNA結合。

優選的，所述P1-P6六條單鏈DNA的序列如SEQ ID NO.1～6所示。

優選的，所述P3單鏈DNA的第38位堿基后修飾有熒光基團，所述P5單鏈DNA的3'端修飾有淬滅基團。

本發明提供了一種制備上述熵驅動DNA四面體納米探針的方法，所述方法包括：

將P3、P5、P6單鏈DNA加入到緩沖液中，經第一反應得到第一復合體；將P1、P2、P4單鏈DNA與第一復合體混合經第二反應即得所述的熵驅動DNA四面體納米探針。

優選的，所述第一反應的反應條件為：95℃5min、72℃5min、65℃5min、55℃5min、37℃10min、25℃10min、4℃；所述第二反應的反應條件為：50℃5min、45℃10min、40℃5min、37℃30min、30℃5min、25℃30min、20℃5min、15℃5min、10℃5min、4℃。

本發明還提供了一種熵驅動DNA鏈置換四面體的microRNA檢測方法，所述檢測方法包括如下步驟：