[發明專利]一種提高重組人PSMA蛋白表達的方法

有效

• 申請號: 202210635084.0
• 申請日: 2022-06-07
• 公開（公告）號: CN114940710B
• 公開（公告）日: 2023-09-26
• 發明（設計）人: 楊佩;林立
• 申請（專利權）人: 愷佧生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/85;C12P21/02
• 代理公司: 上海政濟知識產權代理事務所(普通合伙) 31479
• 代理人: 黃佳麗

1.一種提高重組人PSMA蛋白表達的方法，其特征在于：用ExpiCHO-S細胞進行瞬時表達重組人PSMA蛋白；

具體步驟如下所示：

S1.將PSMA序列用EcoR?I和Hind?III連接至pTT5上，得到的質粒轉化至DH5α感受態細胞中，挑菌擴大培養，獲得大量高純度的質粒；

S2.復蘇好待轉的ExpiCHO-S細胞，并進行放大傳代；

S3.完成細胞和質粒的準備后，將其輕柔的充分混合；

S4.電轉后進行孵育；

S5.接種培養；

S6.培養1-15天后，進行純化；

所述S1中質粒的具體制備方法為：選擇Uniprot?Q04609氨基酸序列Lys44-Ala750，通過信號肽篩選，最終選擇Luciferase?SP為最終的信號肽，按照Expi?293的優化原則，對核酸序列進行優化，優化后的核酸序列如SEQ?ID?No.1所示，在序列的5＇端添加EcoR?I和Kozak序列GCCGCCACC，在信號肽后加入8*His作為標簽，同時在序列3＇端添加終止子和HindIII序列，將核酸序列發送至基因合成公司進行全基因合成，最后通過EcoR?I和Hind?III連接至pTT5載體上，此時獲得PSMA重組質粒。

2.如權利要求1所述的一種提高重組人PSMA蛋白表達的方法，其特征在于：采用流式電轉儀電轉PSMA質粒至ExpiCHO-S細胞內，培養1-15天收樣。

3.如權利要求1所述的一種提高重組人PSMA蛋白表達的方法，其特征在于：所述復蘇好待轉的ExpiCHO-S細胞，細胞代次必須為復蘇三代以后，傳代時間在一個月以內；

所述復蘇過程需要添加終濃度為4-6mM培養基添加劑；

所述放大傳代，每次按照0.5-1*10^6cells/mL進行傳代，最大細胞密度不要超過6*10^6cells/mL。

4.如權利要求1所述的一種提高重組人PSMA蛋白表達的方法，其特征在于：所述電轉的工作參數如下：

電壓設置為150-300V；

脈寬1000-3000μs；

電極次數3-6次；

時間間隔300-600ms；

流速3-6mL/min；

設置為搖擺。

5.如權利要求1所述的一種提高重組人PSMA蛋白表達的方法，其特征在于：所述電轉的工作參數如下：

電壓設置為200V±50；

脈寬2000μs±100；

電極次數4.5次±0.5；

時間間隔611ms±20；

流速4.71mL/min±1；

設置為搖擺。

6.如權利要求1所述的一種提高重組人PSMA蛋白表達的方法，其特征在于：所述孵育為：37℃培養箱靜置孵育10-30min。

7.如權利要求1所述的一種提高重組人PSMA蛋白表達的方法，其特征在于：所述接種培養的具體步驟如下：

S5-1.將孵育完成的細胞表面殺菌處理后，移除上層白色絮狀物，將下層電轉后的細胞小心轉移至含有預熱培養基的3000mL培養搖瓶內，于37℃恒溫培養搖床中培養5-20min；

S5-2.以活細胞密度為4-6*10^6進行接種培養,于37℃恒溫培養搖床中培養16-24h后進行補料，加入補料培養基，并且之后每隔一天需要補糖和補加補料培養基。

8.如權利要求1所述的一種提高重組人PSMA蛋白表達的方法，其特征在于：所述純化為：采用0.1-0.8um濾器進行過濾，進行后續的純化。