[發明專利]一種基于乙酰輔酶A代謝改造后高效合成四氫嘧啶的基因工程菌的構建和應用

在審

• 申請號: 202210631190.1
• 申請日: 2022-05-30
• 公開（公告）號: CN114806995A
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 張山;甘淼;陳永麗;丁利平
• 申請（專利權）人: 深圳中科欣揚生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/77;C12N15/54;C12P17/12;C12R1/15
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種基于乙酰輔酶A代謝改造后高效合成四氫嘧啶的基因工程菌的構建和應用，屬于代謝工程領域。本發明以谷氨酸棒桿菌為宿主，通過對其代謝通路進行改造，提高了乙酰輔酶A的補給，從而提升了利用EctABC基因簇合成四氫嘧啶的產量。具體是將谷氨酸棒桿菌中的編碼磷酸乙酰轉移酶、乙酰輔酶A酰基轉移酶、PRPP結合酶基因中的一個或多個敲除，并整合來源于釀酒酵母的腺苷激酶、腺苷酸激酶和核苷二磷酸激酶，并同時表達EctABC基因簇。構建得到的基因工程菌在50L發酵罐條件中發酵，四氫嘧啶產量可達到66.3g/L。

技術領域

本發明涉及一種基于乙酰輔酶A代謝改造后高效合成四氫嘧啶的基因工程菌的構建和應用，具體涉及一種采用代謝工程手段構建高產四氫嘧啶的基因工程菌并用于四氫嘧啶生物合成的方法，屬于代謝工程領域。

背景技術

四氫嘧啶(Ectoine，ECT)又名依克多因，發現于極端微生物嗜鹽菌中，是一種氨基酸衍生物，其對滲透壓有調節作用，常作為滲透壓補償性溶質存在于耐鹽菌中。四氫嘧啶可以提高細胞的抗逆性，對細胞起到保護作用，也可以穩定生物體內酶的蛋白結構，具有優異的抗炎、防曬、保濕功能，是高檔化妝品中常見的生物制劑之一。

由于四氫嘧啶結構的特殊性，化學合成法的后續分離成本過高，因此，常采用生物發酵法合成。傳統的四氫嘧啶生物發酵法，采用的是“細菌擠奶”法，即野生的或經過篩選的嗜鹽微生物在高鹽、高滲環境下合成目的產物，然后在低鹽、低滲環境下提取四氫嘧啶的方法。在C.Fallet等人采用Chromohalobacter salexigens發酵生產四氫嘧啶，可以達到2.1g·L^-1·h^-1的產能(Process Optimization of the Integrated Synthesis andSecretion of Ectoine and Hydroxyectoine Under Hyper/Hypo-Osmotic Stress，公開于2010年)。但是這種方法具有鹽濃度高、不連續生產的缺點，會造成設備腐蝕、生產純化工藝復雜等問題。

因此，近些年來，科學家們將來自嗜鹽菌的ECT合成基因轉入工程菌中，希望在相對低鹽條件下連續生產四氫嘧啶。南京眾惠將延長鹽單胞菌中的ectABC基因轉入大腸桿菌中，在低鹽培養基中，采用L-天冬氨酸鈉為底物，在搖瓶發酵體系中發酵生產四氫嘧啶，24h后每克菌體含1.1g四氫嘧啶(專利公開號：CN104560844A)。中科院微生物所Yong-Zhi He等采用全細胞催化的方式，以天冬氨酸和甘油為底物，在大腸桿菌中生產四氫嘧啶，24h后四氫嘧啶產量達到25.1g·L^-1(High production of ectoine from aspartate andglycerol by use of whole-cell biocatalysis in recombinant Escherichia coli，公開于2015年)。清華大學將ectABC基因簇轉入谷氨酸棒狀桿菌中，以葡萄糖為底物生產四氫嘧啶，在5L發酵罐體系中發酵72h后四氫嘧啶產量達到12g·L^-1(專利公開號：CN107142234A)。無錫晶揚將ectABC基因簇轉入谷氨酸棒狀桿菌中，并對宿主菌代謝通路進行改造，以葡萄糖為底物產四氫嘧啶，在2.5L發酵罐體系中發酵60h后四氫嘧啶產量達到41.7g·L^-1(專利公開號：CN110699310A)。

目前，對比“細菌擠奶”法，采用基因工程菌發酵生產四氫嘧啶的方法解決了生產過程中高鹽環境對設備腐蝕的問題，可以補料分批生產，極大簡化了生產、純化工藝。但是，對比大腸桿菌，谷氨酸棒狀桿菌不生產內毒素，是食品安全級工程菌，但是在直接應用至四氫嘧啶發酵生產時，生產效率相對較低。如何進一步提高四氫嘧啶的產量，是本領域中仍需要解決的問題。

發明內容

本發明采用代謝工程手段，對谷氨酸棒狀桿菌中，四氫嘧啶的合成相關底物的補給進行調整，使宿主菌更適合生產四氫嘧啶，在使用食品安全級菌種的前提下，提高基因工程菌單位時間內四氫嘧啶產量。