[發明專利]一種野生型IMPDH II蛋白的表達純化方法

在審

• 申請號: 202210630142.0
• 申請日: 2022-06-06
• 公開（公告）號: CN115029330A
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發明（設計）人: 楊少青;周超強;洪心珠;逢淑召
• 申請（專利權）人: 上海健耕醫藥科技股份有限公司;上海云澤生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/70;C07K19/00;C12R1/19
• 代理公司: 上海領匠知識產權代理有限公司 31404
• 代理人: 李華

1.一種野生型IMPDH II蛋白的表達純化方法，包含下列步驟：

S1.克隆或合成獲得含野生型IMPDH II序列的重組核酸片段；

S2.構建重組載體，將重組載體轉化至宿主細胞，得到基因工程菌；

S3.發酵培養：所述基因工程菌活化后，進行擴大培養，再采用自誘導培養基進行發酵培養；

S4.IMPDH II蛋白純化；

其特征在于，步驟S3中所述自誘導培養基由下列組分組成：

α-乳糖：2g/L；葡萄糖：0.5g/L；甘油：5g/L；KH₂P0₄：3.4g/L；

MgSO₄：0.49g/L；蛋白胨：10g/L；Na₂HPO₄ 3.55g/L；Na₂SO₄：0.71g/L；

NH₄Cl:2.67g/L；pH 7.4。

2.如權利要求1所述的表達純化方法，其特征在于，所述重組核酸片段含有His標簽，其位于IMPDH II核酸序列的N端。

3.如權利要求1所述的表達純化方法，其特征在于，所述重組核酸片段含有TEV酶剪切位點的核酸序列，其位于His標簽序列和IMPDH II核酸序列中間。

4.如權利要求1所述的表達純化方法，其特征在于，所述重組載體為pET-21a(+)、pET-24a(+)、pET-28a(+)、pET-30a(+)或pET-Duet。

5.如權利要求4所述的表達純化方法，其特征在于，所述重組載體為pET-28a(+)。

6.如權利要求1所述的表達純化方法，其特征在于，所述宿主細胞為BL21(DE3)或ArcticExpress(DE3)pRare2 BL21。

7.如權利要求1所述的表達純化方法，其特征在于，所述宿主細胞為ArcticExpress(DE3)pRare2 BL21。

8.如權利要求1所述的表達純化方法，其特征在于，所述自誘導培養條件為溫度10-20℃，pH7-8。

9.如權利要求1所述的表達純化方法，其特征在于，所述自誘導培養條件為先37℃培養至菌液OD₆₀₀為3.0-4.0，然后12℃繼續培養至菌液OD₆₀₀為14-19。

10.如權利要求1所述的表達純化方法，其特征在于，所述步驟S4中，所述蛋白純化步驟：

a.菌體稱重

b.按照1g濕菌體加入50ml Buffer A的量重懸菌體并使用均質機破碎細胞

c.使用AKTA Pure蛋白純化儀和His trap HP預裝柱純化蛋白

d.透析和超濾濃縮蛋白

所用溶液如下：

裂解液：50mM KH₂PO₄,300mM KCl,20mM咪唑,0.8M尿素,pH8.0；

洗脫液：50mM KH₂PO₄,300mM KCl,500mM咪唑,0.8M尿素,pH8.0；

透析液：50mM KH₂PO₄,300mM KCl,1mM DTT,0.8M尿素,1mM EDTA,1mM PMSF,pH8.0。