[發(fā)明專利]表達SAT2型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的枯草芽孢桿菌及應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210629321.2
• 申請日: 2022-06-02
• 公開（公告）號: CN114806994A
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發(fā)明（設計）人: 鄭海學;茹毅;陳嬌;郝榮增;楊洋;李亞軍;劉華南;盧炳州;張貴財;毛玉涵;張越;吳秀萍;趙東梅;任蕊芳
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/42;C12N15/75;A61K39/135;A61P31/14;C12R1/125
• 代理公司: 北京力量專利代理事務所(特殊普通合伙) 11504
• 代理人: 毛婷

1.一種表達SAT2型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的重組枯草芽孢桿菌WB800N/pHT43-VP1，其特征在于，所述重組枯草芽孢桿菌WB800N/pHT43-VP1是將編碼SAT2型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的基因或表達SAT2型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的重組載體/質(zhì)粒導入枯草芽孢桿菌WB800N獲得。

2.如權(quán)利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌WB800N/pHT43-VP1，其特征在于，所述重組枯草芽孢桿菌WB800N/pHT43-VP1的制備方法為：全基因合成SAT2型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因；將SAT2型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因連接至pHT43質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHT43-VP1；將重組質(zhì)粒pHT43-VP1轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB800N感受態(tài)細胞獲得重組枯草芽孢桿菌WB800N/pHT43-VP1。

3.如權(quán)利要求2所述的重組枯草芽孢桿菌WB800N/pHT43-VP1，其特征在于，所述擴增SAT2型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因的引物為：

pHT43-VP1-F：atcagccgtaggatccATGACTACCTCGGCGGGAGAAGGCGCAGA，其中，小寫部分為同源臂基因序列；

pHT43-VP1-R：tcattaggcgggctgcTCAATGGTGGTGATGGTGATGCAGGGTCTGTC，其中小寫部分為同源臂基因序列；斜體部分為6×His標簽基因序列。

4.如權(quán)利要求3所述的重組枯草芽孢桿菌WB800N/pHT43-VP1，其特征在于，所述SAT2型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

5.如權(quán)利要求2所述的重組枯草芽孢桿菌WB800N/pHT43-VP1，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化為電轉(zhuǎn)化。

6.如權(quán)利要求5所述的重組枯草芽孢桿菌WB800N/pHT43-VP1，其特征在于，所述電轉(zhuǎn)化為：

(1)向枯草芽孢桿菌WB800N感受態(tài)細胞中加重組質(zhì)粒pHT43-VP1，冰浴后加入電轉(zhuǎn)杯，電轉(zhuǎn)儀設置為2.5kv、25μF、2000Ω、持續(xù)時間4.5ms，電擊1次；

(2)取出電轉(zhuǎn)杯，加入復蘇培養(yǎng)基RM，37℃、200rpm復蘇3h，取200μL菌液涂布于Cm抗性(10μg/mL)的2×YT固體平板培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。

7.如權(quán)利要求5所述的重組枯草芽孢桿菌WB800N/pHT43-VP1，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌WB800N感受態(tài)細胞的制備方法為：

(1)挑取枯草芽孢桿菌WB800N單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm培養(yǎng)18h；

(2)取步驟(1)所述過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至GM液中，使OD₆₀₀＝0.2左右，于37℃、200rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀＝1.0左右；

(3)取步驟(2)中的全部菌液冰浴，4℃、5000rpm離心8min，棄掉上層廢液，收集下層沉淀中的菌體；

(4)4℃預冷電轉(zhuǎn)緩沖液ETM，每次加入40mL電轉(zhuǎn)緩沖液ETM洗滌步驟(3)所述菌體，4℃、5000rpm離心8min，棄掉上層廢液，保留下層沉淀，反復3次；

(5)將步驟(4)洗滌后的菌體重懸于500μL步驟(4)所述的ETM中，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

8.如權(quán)利要求1-7任一所述的重組枯草芽孢桿菌WB800N/pHT43-VP1在制備SAT2型口蹄疫病毒疫苗中的應用。

9.如權(quán)利要求1-7任一所述的重組枯草芽孢桿菌WB800N/pHT43-VP1在制備預防或治療SAT2型口蹄疫病毒感染藥物中的應用。

10.如權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于，所述重組枯草芽孢桿菌WB800N/pHT43-VP1加入藥學上可接受的載體制成口服液、散劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑、乳劑、混懸劑、注射劑、噴霧劑、滴劑、貼劑或軟膏劑中的任一種。