[發明專利]一種基于SNP標記的高直鏈淀粉硬粒小麥快速輔助育種方法

在審

• 申請號: 202210622311.6
• 申請日: 2022-06-02
• 公開（公告）號: CN114921585A
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 張楠;李亞青;李孟軍;史占良;彭義峰;張士昌;何明琦;周廣英
• 申請（專利權）人: 石家莊市農林科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 石家莊輕拓知識產權代理事務所(普通合伙) 13128
• 代理人: 張培元

本發明公開了一種基于SNP標記的高直鏈淀粉硬粒小麥快速輔助育種方法，采用高特異性的基于不等長引物等位特異性PCR的SNP標記，在設定的PCR反應體系和PCR擴增程序下，基于瓊脂糖凝膠電泳染色條帶區分鑒定突變位點和非突變位點，測定待測植株中一組或多組特定SNP位點單核苷酸多態性，進行高直鏈淀粉硬粒小麥的快速輔助育種。本發明成功開發了高效進行高直鏈淀粉硬粒小麥分子標記輔助育種的共顯性的基于不等長引物等位特異性PCR的SNP標記，解決了高直鏈淀粉硬粒小麥的快速育種需求。

技術領域

本發明涉及小麥分子育種領域，尤其涉及功能性小麥分子育種相關技術領域。

背景技術

抗性淀粉具有預防II 型糖尿病、肥胖癥、心血管疾病和腸道疾病的作用。隨著人們對身體健康關注程度的提高，社會對富含抗性淀粉食品的需求不斷提高。小麥面粉中直鏈淀粉的含量與抗性淀粉含量呈顯著正相關。美國、英國、澳大利亞、日本等國對高直鏈淀粉小麥研究較為深入，但國內缺乏高直鏈淀粉小麥種質資源，尚未見高直鏈淀粉小麥種質創新和新品種選育的報道。

硬粒小麥約占全球小麥播種面積的10%，主要用于制作pasta、couscous和flatbread。與普通小麥相比，硬粒小麥耐逆性好，同時具有高蛋白、高賴氨酸、高胡蘿卜素和富含微量元素等特點。因此，提高硬粒小麥直鏈淀粉和抗性淀粉含量，創制高直鏈淀粉硬粒小麥新種質和選育硬粒小麥新品種，對于豐富人們餐桌、提高小麥生產積極性和人們健康水平均具有重要意義。

Uauy 等（2009）從春性硬粒小麥（Kronos）EMS突變體庫中篩選出SBEIIa-A（G401A）、SBEIIa-B （G1347A）、SBEIIb-A（G308A）和SBEIIb-B（C1290T）突變體。每個突變體SBEIIa或SBEIIb基因僅有1個SNP位點發生突變。通過回交和直接測序技術，Uauy 等創制了上述4個基因SNP位點均發生突變的高直鏈淀粉硬粒小麥（PI670160）。以硬粒小麥（PI670160）為親本，開展高直鏈淀粉硬粒小麥育種時，由于其高直鏈淀粉性狀由SBEIIa-A、SBEIIa-B、SBEIIb-A和SBEIIb-B 4個基因的點突變決定，因此，基于SBEIIa和SBEIIb SNP突變位點開發SNP分子標記成為高直鏈淀粉硬粒小麥育種的關鍵。目前，SNP 檢測方法主要有以單鏈構象多態性、等位基因特異性PCR（AS-PCR）、酶切擴增多態性標記（CAPS）等為代表以凝膠電泳為技術基礎的經典方法和以變性高效液相色譜(DHPLC)、質譜檢測技術(MS)、高分辨率熔解曲線分析(HRM) 、競爭性等位基因特異性PCR （KASP)等為代表的高通量、自動化程度較高的檢測方法。前者操作復雜、成本高和準確度不高；后者需要昂貴的儀器設備和試劑耗材。

不等長引物等位特異性PCR引物是一種基于等位基因特異性PCR原理的改良SNP標記，僅需普通PCR 儀及瓊脂糖凝膠電泳，適用于中小實驗室。不等長引物等位特異性PCR是一種共顯性標記，同時其具有操作簡便、成本低和易于區分的特點。因此，開發基于硬粒小麥（PI670160）SBEIIa-A、SBEIIa-B、SBEIIb-A和SBEIIb-B 4個基因的點突變的不等長引物等位特異性PCR引物（SNP標記）對于中小實驗室開展高直鏈淀粉硬粒小麥育種具有很高的應用價值，從而推動我國高直鏈淀粉硬粒小麥育種工作。但是，硬粒小麥是部分同源的異源四倍體，硬粒小麥部分同源基因SNP標記的開發，特別是適用于中小實驗室的SNP標記的開發，具有很高的難度，尚未見報道。

發明內容